灯盏乙素抑制NOX 的表达改善非酒精性脂肪性肝病肝脏纤维化的研究

杨永锐 ，王丽媛 ，李海雯 ，赵智蓉 ，普 瑞 ，吴贵帅 ，李树德

（1）昆明市第三人民医院肝病科 云南省传染性疾病临床医学中心，云南 昆明 650041;2）昆明医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系;3）基础医学院，云南 昆明 650500）

在大部分慢性肝病的晚期，由于胶原纤维蛋白（collagen fibrin，CF）的过度表达，形成细胞外基质，导致肝脏组织损伤后修复障碍引起肝脏的纤维化发生[1-2]。早期的肝脏纤维化是一个可逆的病理过程，随着进一步的进展，会增加患者的死亡率[3]。在纤维化发生和发展的过程中，由氧化应激诱导的肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）和异常炎症级联反应的激活是肝纤维化的中心驱动因素[4]。氧化应激的发生是由于抗氧化能力和活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生之间的不平衡导致，由还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NOX）产生的ROS 在氧化应激中占据主导地位。在哺乳动物中NOX 的亚型有NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5 和DUOX1-2。在肝脏中，NOX 以吞噬形式和非吞噬形式进行功能性表达，近年来的研究表明，吞噬NOX2 和非吞噬NOX 亚型，包括NOX1 和NOX4，都介导HSC中不同的促成纤维作用[5]。然而，通过NOX2 和NOX4 介导的ROS 产生在NAFLD 诱导肝脏纤维化的调控机制有待深入研究。

灯盏乙素（scutellarin，SCU）是从菊科短葶飞蓬植物灯盏花中提取出来的生物活性黄酮类化合物，在云南省分布占全球的95%以上[6]。SCU 具有多种药理特性，包括抗炎、抗氧化、减少心肌缺血大鼠的梗死面积、减轻心肌纤维化和功能障碍、抑制心肌肥厚，防止阿霉素诱导的急性心脏毒性等。在临床上，SCU 主要被运用于脑卒中和心肌梗死治疗[7]。既往研究表明，在猪血清诱导的大鼠肝脏纤维化中，SCU 可以通过抑制HSC 的活化，调节ECM 的合成和降解而起到抗纤维化的作用[6]。在高脂喂养的雄性C57BL/6 小鼠以及在油酸诱导脂质积累的HepG2 细胞中发现SCU 能通过PPARc/PGC-1a-Nrf2 信号通路增强抗氧化剂的水平，减少脂质过氧化作用从而起到保护肝脏的作用[8]。然而，SCU 是否能在肝脏纤维化中通过抑制NOX 的生成起调节氧化应激的作用尚不清楚。因此，在本研究中，通过高脂高糖饮食喂养SD 大鼠建立NAFLD 动物模型，依据课题组前期实验结果[9]建立SCU 低、中、高剂量治疗组，探讨SCU 能否在NAFLD 动物模型中降低氧化应激相关蛋白NOX2 和NOX4 的表达，减少ROS 的生成，抑制氧化应激，从而改善肝脏的纤维化程度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物体重为180～220 g 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠由昆明医科大学实验动物学部提供，动物合格证编号：SCXK（滇）K2020-0004，SPF 级。实验动物的饲养条件为：恒温（22±2）℃，恒湿（55±5）%，昼夜明暗交替时间12/12h。本研究通过大理大学伦理委员会审核。

1.1.2 主要试剂灯盏乙素（云南植物药业有限公司）；大鼠ROS 检测试剂盒（钰博生物）；NOX2、NOX4 一抗（Affinity Bioscience）；二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；PVDF 膜（Millipore Corporation）；ECL 化学发光底物试剂盒（Biosharp）等。

1.1.3 主要设备半干转膜仪221BR 51253（美国BIO-RAD 公司）；冰冻切片机CM1950（德国徕卡相机股份有限公司）；直流电泳仪（北京六一仪器厂）；全波段酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；石蜡包埋机（Leica Biosystems）等。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组将180～220 g 的雄性SD大鼠60 只，适应性喂养2 周后随机分为6 组，每组10 只，分别为正常组、模型组、SCU 低剂量治疗组、SCU 中剂量治疗组、SCU 高剂量治疗组、姜黄素阳性药物治疗组。

1.2.2 实验动物造模除了正常组给予正常饲料24 周外，其余各实验组给予高脂高糖饮食喂养24 周。

1.2.3 SCU 灌胃治疗及取材造模24 周后，SCU低、中、高剂量治疗组分别采用25 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）的SCU 灌胃治疗，姜黄素阳性药物治疗组采用200 mg/（kg·d）的姜黄素灌胃治疗；治疗期间，模型对照组，SCU 低、中、高剂量治疗组以及姜黄素阳性药物治疗组继续给予高脂高糖饮食喂养。8 周后，大鼠禁食8～12 h，1%戊巴比妥钠麻醉状态下取血，4 000 r/min，离心5 min 获得血清；取部分肝脏组织及4%多聚甲醛固定24 h，流水冲洗3 h，进行梯度酒精脱水、二甲苯透明和石蜡包埋，用于形态学和免疫组织化学检测。部分肝脏组织液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 大鼠体重、肝重和肝脏指数的测定灌胃治疗8 周后，称取各组大鼠体重。麻醉状态下，称取各组大鼠肝重，并计算肝脏指数。肝脏指数（%）=肝脏重量（g）/体重（g）×100%[10]。

1.2.5 血清ROS 测定取各组大鼠的血清，严格按照说明书步骤进行。通过酶标仪检测各组血清的OD 值，按照说明书要求计算出血清中ROS的含量。

1.2.6 肝脏组织ROS 的测定称取一定量的新鲜大鼠肝脏组织于预先加入预冷PBS 的EP 管中置于超声破碎仪中，制备成10%的组织匀浆，严格按照说明书进行操作，检测其OD 值，根据标曲公式计算出组织中ROS 的含量。

1.2.7 肝脏组织油红“O”染色10 µm 的冰冻切片置于常温中平衡30 min 后，用甲醛钙固定液固定10 min，油红“O”染液染色10 min，60%异丙醇分化，流水终止分化，苏木素复染核3 min，自来水返蓝，甘油明胶封片，在光学显微镜在观察分析。

1.2.8 肝脏组织Masson 染色石蜡包埋的肝脏组织制备4 µm 的组织切片，常规脱蜡至水。切片入Bouin 液于60 ℃恒温温箱媒染2 h，然后流水冲洗至切片上的黄色消失，天青石蓝滴染3 min，Mayer 苏木素滴染3 min，酸性乙醇分化液稍分化后流水冲洗10 min，丽春红品红滴染10 min，磷钼酸处理10 min，倾去上液直接滴加苯胺蓝染5 min，最后弱酸处理2 min 后进行95%乙醇快速脱水，无水乙醇脱水以及二甲苯透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察分析。

1.2.9 Western blot 检测肝脏组织中的NOX2、NOX4 的表达称20～30 mg 的大鼠肝脏组织于1.5 mL 的EP 管中，每管加入RIPA 组织裂解液300 µL 与PMSF 3 µL，混匀，置于超声细胞破碎仪中进行破碎，12 000 r/min，离心10 min，取上清液。BCA 法测定蛋白浓度。每组取40 µg 蛋白进行SDS-PAGE 电泳，电泳结束后，根据所需目的因子分子量进行切胶，半干转移法转至PVDF膜上，转膜结束后置于5%的脱脂奶粉中在37 ℃恒温摇床中封闭1 h，后分别加入NOX2、NOX4（1∶1 000）一抗于4 ℃冰箱孵育过夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入相应的二抗结合一抗，常温孵育2 h。洗膜后显影并Image J 进行灰度值分析。

1.2.10 肝脏组织免疫组织化学染色石蜡切片经1%柠檬酸钠抗原修复液修复后，用3%的H2O2孵育30 min，抗原提取后，用5%牛血清孵育30 min。最后滴加NOX2、NOX4（1∶200）一抗在4℃冰箱孵育过夜，PBS 洗涤3 次后滴加即用型免疫组化二抗，常温孵育30 min，PBS 洗涤3次后滴加新鲜配制的DAB 显色3～5 min 后用PBS 冲洗终止显色；苏木素复染2 min，盐酸酒精分化10 s 后用流水8 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，在光学显微镜观察及分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS 统计学软件进行分析；大鼠体重、肝重及肝脏指数用均数±标准差（±s）表示，2组间的比较使用配对t检验，P＜ 0.05 表示差异具有统计学意义。应用GraphPad Prism6.0 进行图表制作。

2 结果

2.1 各组大鼠体重、肝重及肝脏指数的变化

与正常组相比，模型组大鼠体重、肝重及肝脏指数增加明显（P＜ 0.01）；与模型组相比，SCU各治疗组大鼠体重，肝重及肝脏指数下降，且SCU-100 高剂量治疗组大鼠的体重，肝重下降明显（P＜ 0.01），阳性药物治疗组大鼠体重、肝重及肝脏指数下降明显（P＜ 0.01）。结果显示，在高脂高糖饮食诱导的NAFLD 中，大鼠的体重、肝重及肝脏指数均增加，SCU 治疗可以降低大鼠体重、肝重以及肝脏指数，见表1。

表1 大鼠体重、肝重及肝脏指数（±s）Tab.1 Body weight，liver weight and liver index of rats （±s）

表1 大鼠体重、肝重及肝脏指数（±s）Tab.1 Body weight，liver weight and liver index of rats （±s）

与正常组比较，## P ＜ 0.01，与模型组比较，*P ＜ 0.01，**P ＜ 0.01。

2.2 血清ROS 浓度

与正常组相比，模型组血清ROS 浓度增加明显（P＜ 0.01）；与模型组相比，SCU 低治疗组血清ROS 浓度降低（P＜ 0.05），SCU 中、高治疗组血清ROS 浓度降低明显（P＜ 0.01），阳性药物治疗组血清ROS 浓度降低（P＜ 0.05）。结果表明，在高脂高糖饮食诱导的NAFLD 中，血清ROS 浓度增加，SCU 治疗可以降低血清ROS 浓度，见图1。

图1 血清中ROS 的浓度Fig.1 Concentration of ROS in the serum

2.3 肝脏组织ROS 浓度

与正常组相比，模型组肝脏组织ROS 浓度增加明显（P＜ 0.01）；与模型组相比，SCU 各治疗组和阳性药物治疗组的肝脏组织ROS 浓度降低明显（P＜ 0.01）。结果表明，在高脂高糖饮食诱导的NAFLD 中，肝脏组织ROS 浓度增加，SCU 治疗可以降低肝脏组织ROS 浓度，见图2。

图2 肝脏组织中ROS 的浓度Fig.2 Concentration of ROS in the liver tissues

2.4 肝脏组织油红“O”染色

正常组大鼠肝脏组织仅有极少量脂质沉积（图3A）；模型组大鼠肝脏组织中脂质沉积增加（图3B）；SCU 各治疗组大鼠肝脏组织中脂质沉积现象逐渐减少（图3C、D、E）；阳性药物对照组大鼠肝脏组织中脂质沉积也减少（图3F）。结果表明，SCU 可以减少NAFLD 肝脏组织的脂质沉积。

图3 肝脏组织油红“O”染色（×400）Fig.3 Oil red "O" staining of liver tissue（×400）

2.5 肝脏组织Masson 染色

正常组汇管区仅有少量胶原纤维沉积（图4A）；模型组汇管区有大量蓝色胶原纤维沉积且开始向肝细胞延伸（图4B）；与模型组相比，SCU 各治疗组汇管区胶原纤维开始减少，肝脏纤维化的程度有所减轻（图4C、D、E）；阳性药物治疗组汇管区纤维化程度较轻（图4F）。

图4 肝脏组织Masson 染色（×400）Fig.4 Masson staining of liver tissue（×400）

2.6 NOX2、NOX4 蛋白质的表达

Western blot 结果显示：与正常组相比，模型组NOX2 的蛋白表达增加（P＜ 0.05）；与模型组相比，SCU 各治疗组NOX2 的蛋白表达下降（P＜0.05）；阳性药物治疗组NOX2 表达下降（P＜ 0.05）。与正常组相比，模型组NOX4 的蛋白表达增加（P＜ 0.05）；与模型组相比，SCU 各治疗组NOX4的蛋白表达下降（P＜ 0.05）；阳性药物治疗组NOX4 表达下降（P＜ 0.05），见图5。

图5 肝脏组织中NOX2、NOX4 的蛋白表达Fig.5 Protein expression of NOX2 and NOX4 in liver tissues

2.7 免疫组织化学结果显示：

NOX2、NOX4 在肝细胞胞质内表达，呈黄棕色。与正常组相比，模型组肝脏细胞内光密度升高，NOX2、NOX4 蛋白表达增加（P＜ 0.05）；与模型组相比，SCU 各治疗组肝脏细胞光密度降低，NOX2、NOX4 蛋白表达下降（P＜ 0.05）；阳性药物治疗组肝脏组织光密度降低，NOX2、NOX4 蛋白表达下降（P＜ 0.05）。免疫组织化学与Western blot 的NOX2、NOX4 趋势一致（图6）。

图6 肝脏组织中NOX2、NOX4 蛋白的表达（×400）Fig.6 Expression of NOX2 and NOX4 proteins in liver tissue （×400）

3 讨论

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已经成为全球最常见的慢性疾病之一，它是一种与肥胖相关的慢性肝病，由特定的遗传背景、各种环境和代谢因素相互作用而导致的全身性疾病[11]。在NAFLD 的发生过程中常伴随着伴有肝脏炎症、纤维化以及晚期的肝硬化[12]。肝脏纤维化是各种慢性肝病发展过程中最常见的病理过程，也是决定肝病预后的关键因素[13]；早期的肝脏纤维化是一种可逆的伤口愈合过程，是以细胞外基质的沉积为特征的反应[14]。HSC 作为纤维化的主要媒介，在受损肝细胞产生的ROS 刺激下被激活并转化为肌成纤维细胞（myofibroblasts，MFB）表型，参与到损伤修复中[15]。因此，在肝纤维化时期如果损伤因素持续存在，将会逐渐发展为肝硬化。肝纤维化可以通过抑制多种途径（如：氧化应激，肝细胞损伤和HSC 激活）来得到逆转[16]。中药及其主要成分对复杂疾病的病理机制可以发挥综合性的优势，许多中药都具有明显的抗炎、抗氧化作用[17]。SCU是从传统中草药灯盏花中提取的主要成分，已经有600 多年的使用历史[18]。有研究表明，SCU 具有清除氧自由基和抗氧化的作用[19]。另外，姜黄素（curcumin，CUR）是从姜黄根茎中提取的主要活性成分，许多研究已经表明姜黄素能够改善脂肪变性、炎症和纤维化进展，并且能在体外阻止HSC 的激活[20]。因此，CUR 在本实验中作为阳性对照。在本研究中，通过高脂高糖饮食构建NAFLD 大鼠模型，在给予SCU 灌胃治疗8 周后，发现不同浓度的SCU 和阳性药物姜黄素治疗后大鼠的体重、肝重和肝脏指数均下降，SCU 高剂量和姜黄素的治疗效果较为明显。为了判断SCU 对肝脏组织脂质沉积的影响，笔者采用油红“O”染色后表明，SCU 及姜黄素治疗肝脏组织脂滴的面积减少，SCU 显著改善脂质的沉积。Masson 染色的结果也发现，SCU 和姜黄素均能减轻胶原纤维的沉积。

在肝脏的胶原纤维的沉积导致的纤维化中，ROS 诱导的氧化应激扮演关键的角色。目前认为，氧化应激是抗氧化剂酶的活性不平衡，导致产生过量的ROS，过度的ROS 生成和积累参与了NAFLD 的进展[21]。对于ROS 的来源，主要是在线粒体和内质网中产生，其中线粒体是通过诱导电子运输和解耦联而产生ROS 的主要细胞器[22]。研究表明，NOX 和细胞色素氧化还原酶的催化作用是生成ROS 的主要方式。NOX 是肝细胞ROS生成的主要酶，HSC 和kuffer 细胞是肝脏中NOX表达的两个关键细胞，KCs 促进NOX2 表达，HSC 增加NOX1、NOX2 和NOX4 表达，NOX 的表达上调，增加ROS 的合成，诱导氧化应激在肝脏纤维化过程中发挥着重要作用[23]。因此，笔者在NAFLD 的动物模型中，给予SCU 的治疗后发现：NOX2 和NOX4 在NAFLD 的肝脏组织表达上调，ROS 在血清和肝脏组织的含量增加。通过不同浓度SCU 和姜黄素治疗后：NOX2 和NOX4 在NAFLD 的肝脏组织表达下调，ROS 在血清和肝脏组织的含量降低。结果发现，NAFLD 的肝脏纤维化与NOX2 和NOX4 的表达增加，促进ROS 诱导买的氧化应激有关；SCU 和姜黄素能够通过下调NOX2 和NOX4 的蛋白表达，减少ROS 的合成，抑制氧化应激，改善NAFLD 导致的肝脏纤维化。

综上所述，SCU 能够减轻NAFLD 的脂质代谢紊乱，其机制可能是降低肝脏组织NOX2 和NOX4 基因的表达，减少ROS 的合成，抑制ROS诱导的氧化应激，改善肝脏的纤维化。该研究将为SCU 治疗NAFLD 诱导的肝脏纤维化提供科学的理论依据。