HLA-G 通过促进活化性受体的表达增强NK 细胞对宫颈癌细胞的杀伤作用

刘 倩，哈提拉·吐尔逊，阿仙姑·哈斯木

（新疆医科大学基础医学院，新疆地方病分子生物学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054）

全世界范围内，女性宫颈癌的发病率位居第4，仅次于乳腺癌、结直肠癌和肺癌。其中三分之一以上病例出现在中国和印度[1]。在中国，由于缺乏广泛的筛查，宫颈癌仍然是中低等收入地区妇女的常见生殖系统恶性肿瘤[2]。

研究表明，人类白细胞抗原G （HLA-G）是孕妇对胎儿提供免疫耐受的中心蛋白，在肿瘤组织中，HLA-G 表达显著升高[3]。在乳腺癌、胰腺癌以及卵巢癌细胞中过表达HLA-G 可抑制NK 细胞的杀伤，HLA-G 表达水平降低可恢复NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤[4]。许多研究表明，HLA-G 及其受体可能是肿瘤免疫治疗中重要的检查点[5]。

自然杀伤（natural killer，NK）细胞是机体抵抗肿瘤的重要屏障，与淋巴细胞不同，NK 细胞不需要特异性抗原致敏，可通过分泌γ-干扰素（interferon-γ，IFNγ），肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等细胞因子介导细胞毒性作用[6]。多项研究表明，NK 细胞可通过多种途径发挥强大的抗肿瘤作用。NK 细胞表达一系列免疫受体，以识别靶细胞上的相关配体，维持NK 细胞活化与耐受之间的免疫平衡[7]。NK 细胞对靶细胞的杀伤依赖于NK 细胞表面活化性受体的上调，继而释放穿孔素（Granzyme）、颗粒酶（Perforin）等杀伤介质，发挥抗肿瘤作用。肿瘤细胞可以通过劫持这些受体-配体系统来破坏免疫细胞介导的细胞溶解来逃避免疫监视[8]。研究表明，HLA-G 可作为配体抑制NK 细胞上表达的活化性受体，可直接降低NK 细胞的肿瘤杀伤能力[9]。然而，在NK 细胞的活化性受体中，NKG2D、NKP30 已被深入研究，但其表达水平与NK 细胞对宫颈癌细胞杀伤的影响报道较少。

本研究拟在宫颈癌细胞及正常宫颈上皮细胞中检测HLA-G 的表达差异，并进一步探讨HLAG 如何影响NK 细胞对宫颈癌细胞的杀伤能力，HLA-G 及其活化性受体NKG2D、NKP30 是否可作为新的宫颈癌免疫检查点，以期为宫颈癌免疫治疗新的靶点发现提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 宫颈癌细胞株培养，构建HLA-G 稳定低表达细胞株

本课题所使用的宫颈癌细胞系C33a（HPV16+）、SiHa（HPV16-），正常宫颈上皮细胞H8 均购自普诺赛（武汉）细胞库。3 种细胞系培养基一致，DMEM 中加入10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素、链霉素混合物。细胞在37 ℃、5% CO2条件下，放入细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，美国）中培养。每隔2 d 更换培养基并在显微镜下观察细胞状态。

将C33a、SiHa 接种至6 孔板中，待细胞长至40%时，将HLA-G 稳定低表达慢病毒载体（吉凯，上海）加入细胞上清液中，感染宫颈癌细胞（shHLA-G-C33a，shHLA-G-SiHa）。约20 h 后加入含嘌呤霉素（1 µg/mL）的培养基培养5～7 d，后加入含嘌呤霉素（0.5 µg/mL）的培养基继续维持浓度，进行扩大培养并收集蛋白，采用WB 法进行转染效率的检测。

1.2 实时定量PCR（real-time PCR）

使用Trizol（索莱宝，北京）从C33a、SiHa 及H8 细胞株中提取RNA，并进行RNA 浓度及纯度检测，确保RNA 溶液的A260/A280 的范围在1.8～2.1 之间。按照说明书描述，将RNA 逆转录为cDNA。然后对HLA-G 的引物（生工生物，上海）（表1）进行PCR 扩增（SYBR Green PCR Kit，天根，北京雅安达生物）。用Ct 值计算HLA-G mRNA 相对表达水平，以GAPDH 的表达量作为内参。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

1.3 免疫印迹法（western-blot WB）

检测C33a、SiHa、H8 细胞株及shHLA-G-C33a，shHLA-G-SiHa 稳转株中HLA-G 蛋白的相对表达量。弃培养基，用PBS 溶液将培养好的贴壁细胞漂洗2～3 遍，用预冷的RIPA 裂解液（索莱宝，北京）裂解细胞株中的总蛋白，刮落细胞，转移至EP 管，用Bradford 法测定上清中蛋白浓度。采用SDS-PAGE 法，取20～30 µg 蛋白进行电泳，采用槽式湿转法转移至PVDF 膜，封闭，加入兔抗人HLA-G 多克隆抗体（1∶500）（Abcam 美国），于4 ℃摇床过夜，洗涤后加入抗兔二抗（1∶2 000），加入5%脱脂奶粉室温孵育2 h。以GAPDH（碧云天生物，上海）为内参。

1.4 NK 细胞分选，NK 细胞与宫颈癌细胞共培养

取正常妇女抗凝外周全血累计20 mL，利用淋巴细胞分离液提取单个淋巴细胞，后用PBS 漂洗2 遍。将离心好的沉淀中加入250 µLCD56+磁珠（BD 美国），避光静置30 min。后加入2 mL 的PBS，用移液器吹匀，放置于磁力架上，避光放置10 min，吸出管中上清液，吸取干净后，加入1 mL PBS，重复上述操作并弃去上清。加入培养基，放入细胞培养瓶中过夜培养。调整细胞浓度为1×106个/mL，培养备用。流式细胞仪检测NK 细胞纯度为93.53%（图1）。

图1 NK 细胞流式纯度检测Fig.1 Purity detection of NK cells by flow cytometry

实验共培养细胞共分为6 组：（1）C33a 组，（2）C33a+NK 组，（3）shHLA-G-C33a+NK 组，（4）SiHa 组，（5）SiHa+NK 组，（6）shHLA-G-SiHa+NK 组。细胞共培养效靶比为1∶10，培养48 h后，收取细胞用于后续检测。

1.5 细胞增殖检测（CCK8）

采用CCK8 法检测共培养后C33a 和SiHa 细胞增殖的改变，将对数生长期的C33a 和SiHa 细胞接种于96 孔板。再加入分选的NK 细胞干预48 h 后吸出悬浮的NK 细胞后，各孔加入10 µL的CCK8 工作液（博奥森，北京），将96 孔板置于含5% CO2的37 ℃培养箱中避光孵育4 h。用酶标仪于450 nm 处测定各孔的吸光度（OD）值。

1.6 细胞凋亡

收集1～5×105细胞，PBS 洗涤2 遍。离心后加入0.5 mL 的Binding Buffer（BD 美国）悬浮细胞。加入5 µL AnnexinⅤ-FITC 混匀后，再加入5 µL PI，混匀。室温避光反应5～15 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡状况。

1.7 流式细胞术

与宫颈癌细胞共培养48 h 后，收集悬浮的NK 细胞，PBS 漂洗2 遍，分别加入流式抗体NKG2D、NKP30、Granzyme、perforin（Thermo Fisher Scientific，美国）后，用流式细胞仪进行检测。采用FlowJo 分析软件10.8.1 进行数据分析。

1.8 统计学处理

采用IBM SPSS 21.0 软件及Graphpad Prism 5对所有实验数据进行统计学分析。计量资料服从正态分布采用均数±标准差描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两多重比较采用Dunnett 法，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HLA-G 在宫颈癌细胞株中的表达高于正常宫颈上皮细胞

RT-PCR 检测结果显示：3 组间表达差异有统计学意义（F=25.870，P=0.010），与H8（1±0.061）细胞系相比，HLA-G 在C33a 细胞（1.294±0.068）及SiHa 细胞（1.411±0.045）中的表达明显增高（P＜ 0.05），C33a 与SiHa 间的表达差异无统计学意义（P=0.263），见图2A。

WB 检测结果显示：3 组间表达差异有统计学意义（F=1 455，P＜ 0.001），与H8（1±0.000）细胞系相比，HLA-G 在C33a 细胞（1.373±0.030）及SiHa 细胞（3.101±0.065）中的表达明显增高（P＜0.05），C33a 与SiHa 间的表达差异有统计学意义（P＜ 0.001），图2B。

图2 HLA-G 在宫颈癌及正常宫颈上皮细胞系中的表达差异Fig.2 Difference in HLA-G expression between cervical cancer and normal cervical epithelial cell lines

2.2 宫颈癌细胞系C33a 和SiHa 细胞慢病毒转染后HLA-G 蛋白表达水平降低

WB 检测结果显示，C33a 细胞中，4 组间表达差异有统计学意义（F=29.980，P＜ 0.05），HLAG 在C33a 细胞中NC 组（0.109±0.028）的表达量显著高于shHLA-G-1 组（0.037±0.003）、shHLA-G-2 组（0.021±0.004）及shHLA-G-3 组（0.007±0.001）（P＜ 0.05），见图3A。SiHa 细胞中，4 组间表达差异有统计学意义（F=30.890，P＜0.05），HLA-G在NC 组（0.372±0.055）中的表达明显高于shHLAG-1 组（0.219±0.016）、shHLA-G-2 组（0.160±0.013）及shHLA-G-3 组（0.092±0.016）（P＜ 0.05），见图3B。2 株细胞检测结果一致。

图3 慢病毒转染宫颈癌细胞系后HLA-G 表达情况Fig.3 HLA-G expression after transfection in cervical cancer cell lines

2.3 HLA-G 下调后促进人外周血NK 细胞对宫颈癌细胞的杀伤

HLA-G 下调后，NK 细胞与C33a 及SiHa 细胞共培养，CCK8 法检测共培养后肿瘤细胞增殖能力，结果显示：C33a 细胞中，3 组间差异有统计学意义（F=707.300，P＜ 0.001），与C33a 细胞株（1.916±0.046）相比，C33a+NK 组（1.453±0.054）及shHLA-G-C33a+NK（0.747±0.039）组细胞增殖能力明显减弱（P＜ 0.001），且C33a+NK 组与shHLA-G-C33a+NK 间差异有统计学意义（P＜0.001），见图4A。同样的，SiHa 细胞中，3 组间差异有统计学意义（F=682.400，P＜ 0.001），与SiHa 细胞株（1.943±0.032）相 比，SiHa+NK 组（1.095±0.048） 及 shHLA-G-SiHa+NK（0.472±0.071）组细胞增殖能力明显减弱（P＜ 0.001），且SiHa+NK 组与shHLA-G-SiHa+NK 间差异有统计学意义（P＜ 0.001），见图4B。

图4 CCK8 法检测各组宫颈癌细胞增殖能力Fig.4 CCK8 was used to detect the proliferation of cervical cancer cells

HLA-G 下调后，NK 细胞与C33a 及SiHa 细胞共培养，流式细胞术检测共培养后肿瘤细胞凋亡程度，结果显示：C33a 细胞中，3 组间差异有统计学意义（F=348.100，P＜ 0.001），与C33a 细胞株（3.153±0.360）%相比，C33a+NK 组（7.130±1.404）%及shHLA-G-C33a+NK（23.050±0.873）%组细胞凋亡水平明显 增 加（P＜ 0.05），且C33a+NK 组 与shHLA-G-C33a +NK 间差异有统计学意义（P＜ 0.001），见图5A。SiHa 细胞株中，3 组间差异有统计学意义（F=21.310，P=0.002），与SiHa 组（4.330±1.564）%相 比，SiHa+NK 组（15.240±1.804）%凋亡水平存在升高趋势，但差异无统计学意义（P=0.061），shHLA-G-SiHa+NK（28.810±7.603）%组细胞凋亡水平明显升高（P=0.002），且SiHa+NK 组 与shHLA-G-SiHa+NK 间差异有统计学意义（P=0.026），见图5B。

图5 HLA-G 下调后NK 细胞与C33a 及SiHa 细胞共培养，肿瘤细胞凋亡程度Fig.5 After HLA-G transfection，NK cells were co-cultured with C33a and SiHa cells，detection the degree of apoptosis of tumor cells

2.4 HLA-G 下调促进NK 细胞表面激活性受体NKG2D、NKP30 的表达

HLA-G 下调后，NK 细胞与C33a 及SiHa 细胞共培养，流式细胞术检测共培养后NK 细胞表面NKG2D 的表达，结果显示：C33a 细胞中，3组间差异有统计学意义（F=70.160，P＜ 0.001），与NK 组（1.840±0.505） %相 比，NK+C33a 组（6.557±3.278）%存在升高趋势，但差异无统计学意义（P=0.083），而NK+shHLA-G-C33a 组（22.790±2.121）%NKG2D 表达率明显升高（P＜ 0.001），且NK+C33a 组与NK+shHLA-G-C33a 组间差异有统计学意义（P＜ 0.001）。SiHa 细胞中，3 组间差异有统计学意义（F=153.200，P＜ 0.001），与NK 组（1.840±0.505）%相比，NK+SiHa 组（11.560±1.376）%及NK +shHLA-G-SiHa 组（20.600±1.739）% NKG2D表达率明显升高（P＜ 0.05），且NK+SiHa 组与NK+shHLA-G-SiHa 组间差异有统计学意义（P＜0.001），见图6A。

流式细胞术检测共培养后NK 细胞表面NKP30 的表达，结果显示：C33a 细胞中，3 组间差异有统计学意义（F=123.500，P＜ 0.001）。与NK 组（7.047±1.242）%相比，NK+C33a 组（11.470±0.185）%及NK+shHLA-G-C33a 组（19.050±1.053）%NKP30 表达率明显升高（P＜ 0.05），且NK+C33a组与NK+shHLA-G-C33a 组间差异有统计学意义（P＜ 0.001）。SiHa 细胞中，3 组间差异有统计学意 义（F=10.550，P=0.011），与NK 组相比，NK+SiHa 组（12.770±0.529）%NKP30 表达率存在升高趋势，但差异无统计学意义（P=0.236），而NK+shHLA-G-SiHa 组（21.240±6.455） %NKP30表达率显著升高（P=0.009），NK+SiHa 组与NK+shHLA-G-SiHa 组间差异无统计学意义（P=0.077），见图6B。

流式细胞术检测共培养后Granzyme 的表达结果显示：C33a 细胞中，3 组间差异有统计学意义（F=33.170，P=0.001），与NK 组（14.700%±1.455） %相 比，NK+C33a 组（16.350±2.528） %Granzyme 的表达水平存在升高趋势，但差异无统计学意义（P=0.689），而NK+shHLA-G-C33a 组（29.110±2.894）%Granzyme 表达率显著升高（P=0.001），且NK+C33a 组与NK+shHLA-G-C33a 组间差异有统计学意义（P=0.001）。SiHa 细胞中，3 组间差异有统计学意义（F=6.881，P=0.028），与NK 组相比，NK+SiHa 组（20.330±0.998）%Granzyme 表达率略升高，而NK+shHLA-G-SiHa组（29.840±8.568）%Granzyme 表达率显著升高（P=0.024），而NK+SiHa 组与NK+shHLA-GSiHa 组间差异无统计学意义（P=0.131），见图6C。

流式细胞术检测共培养后Perforin 的表达，结果显示：C33a 细胞中，3 组间差异有统计学意义（F=20.81，P=0.002），与NK 组（17.330±0.503）%相比，NK+C33a 组（20.170±3.947）%Perforin 的表达水平存在升高趋势，但差异无统计学意义（P=0.562），而NK+shHLA-G-C33a 组（33.280±3.935）%Perforin 表达率显著升高（P=0.002），且NK+C33a 组与NK+shHLA-G-C33a 组之间表达差异有统计学意义（P=0.006）。SiHa 细胞中，3 组间差异有统计学意义（F=9.921，P=0.01），与NK 组相比，NK+SiHa 组（24.530±0.806）% Perforin 表达率存在升高趋势，但差异无统计学意义（P=0.152），而NK+shHLA-G-SiHa 组（31.980±6.910）%Perforin 表达率显著升高（P=0.010），而NK+SiHa 组与NK+shHLA-G-SiHa 组间差异无统计学意义（P=0.152），见图6D。

图6 HLA-G 下调后，NK 细胞与宫颈癌细胞共培养，NK 细胞表面激活性受体及杀伤介质的表达Fig.6 After HLA-G transfection，NK cells were co-cultured with cervical cancer cells，the expression of NK cell surface activating receptor and killing agent was observed

3 讨论

全世界范围内，女性宫颈癌发病率位居第4，占所有女性恶性肿瘤的6.6%，因此是一个重大的全球健康挑战，约90%的宫颈癌死亡病例发生在经济欠发达地区。尽管在过去十年中，有效筛查和预防性疫苗接种取得了重大进展，但晚期宫颈癌仍然缺乏有效的治疗策略。因此，新的治疗策略，如免疫治疗的研究迫在眉睫。

HLA-G 的表达最初在母胎界面的细胞滋养层细胞上被发现，HLA-G 可调节母亲免疫细胞的反应，有助于维持对胎儿的免疫耐受[10]。多年来，许多学者研究了HLA-G 在不同类型恶性肿瘤中的表达水平，表明多种恶性肿瘤HLA-G 表达升高，其中包括口腔鳞癌[11]、结直肠癌[12]和乳腺癌[13]等。许多研究表明，HLA-G 在恶性肿瘤中的表达与患者不良的临床结局相关，提示HLAG 在恶性肿瘤进展中发挥重要作用。在宫颈癌中HLA-G 同样发挥促进肿瘤恶性转化的作用，姜等[14]的研究中发现，HLA-G 的表达水平越高，宫颈癌组织分化程度越差。在本研究中，以H8细胞作为阴性对照组，从mRNA、蛋白2 种水平分别在C33a 及SiHa 细胞系中检测HLA-G 的表达水平，结果表明，HLA-G 在宫颈癌细胞中表达水平显著升高。结果与文献中报道的基本一致，说明宫颈癌的发生与HLA-G 的表达水平呈正相关，它的表达升高可能使患者发生宫颈癌的风险增加。Dong 等[15]的研究发现，与未感染HPV 的CIN 患者相比，HPV16/18 感染的CIN 和宫颈癌患者的HLA-G 表达显著升高。本研究中，mRNA水平和HLA-G 在C33a、SiHa 细胞中的表达存在上升趋势，但差异无统计学意义，而蛋白水平，SiHa 细胞中HLA-G 的表达明显高于C33a，且差异有统计学意义，说明HLA-G 蛋白的表达水平升高可能与HPV16 感染密切相关，本研究选用两株宫颈癌细胞系，而Dong 等的研究对象为患者组织样本，且阳性对照组为CIN 组织，研究样本的不同，可能是造成结果不一致的原因。值得注意的是，本研究中转录水平和蛋白水平的检测结果不完全一致，课题组分析，从HLA-G 基因到蛋白发挥功能有可能存在各种未知的调控机制，因此，HLA-G 在宫颈癌中的是否能与高危型人乳头状瘤病毒（HPV）协同促进宫颈癌发生发展及具体的调控机制，课题组将进一步深入研究。

HLA-G 可通过介导抗原递呈来影响宿主的免疫反应。HLA-G 在肿瘤细胞中的表达升高，可能使它们逃脱宿主的免疫监视[16]。几项体外研究表明，与肿瘤细胞相比，HLA-G 下调的白血病、胶质瘤、卵巢癌和肝细胞癌细胞株被NK 细胞更有效地杀死。也有研究报道，用HLA-G 抗体可阻断NK 细胞介导的靶向癌细胞株的裂解，表明HLA-G 的高表达促进肿瘤细胞逃脱宿主的免疫监视[3]。当肿瘤细胞缺乏HLA-G 的表达时，可通过激活性受体的上调激发NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤，杀伤激活性受体主要包括NKG2D、NCR（NKP30、NKP44、NKP46）及CD226，其中NKG2D是具有细胞外凝集素样结构域的跨膜蛋白，它是NK 细胞表面的主要激活性受体[17]。Guerra 等[18]的体内研究发现，敲除NKG2D 基因后，肿瘤体积明显增大，这是首次在基因水平证明NKG2D在恶性肿瘤中的重要免疫监视作用。徐等[19]的研究发现，在肺癌中，NKG2D 与其配体结合后，可激活NK 细胞，诱导机体的抗肿瘤免疫应答。本课题组在宫颈癌C33a 及SiHa 两株细胞中均发现HLA-G 的表达水平与NK 细胞表面NKG2D 表达水平呈负相关，说明HLA-G 作为NKG2D 的配体，它的下调促进了NK 细胞对宫颈癌细胞的杀伤裂解。此外，NK 细胞还可表达天然细胞毒性受体NKP30，它与其配体HLA-G 的结合将一种强烈的激活信号传递给NK 细胞，介导NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。Pende 等[20]的工作首次鉴定了NKP30，证明了该受体在恶性肿瘤细胞裂解中发挥重要作用。研究表明，NKP30 的表达与机体主动清除肿瘤细胞的能力直接相关，相反，降低NKP30 的活性，可一定程度的避免NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤裂解，同时，NKP30 表达不足与恶性肿瘤患者的不良预后密切相关[21]。Banu等[22]的研究发现，用可溶性NKP30 刺激宫颈癌细胞可降低细胞增殖和迁移能力。本研究在C33a 细胞中发现，HLA-G 下调后，NKP30 的表达升高。而在SiHa 细胞系中HLA-G 下调后，NKP30 的表达有上升趋势，但差异无统计学意义，说明NKP30 的表达可能会一定程度的受到HPV病毒的影响，但具体影响机制还需进一步研究。因此，课题组认为HLA-G 与NKG2D 有望成为宫颈癌免疫治疗新的联合靶点，而HLA-G 与NKP30 是否可以成为宫颈癌免疫治疗的联合靶点，有待进一步深入研究。

大量文献表明，NK 细胞可通过释放含有Granzyme 的细胞毒性颗粒或接触启动Caspase 级联反应的死亡受体来消除肿瘤细胞。Granzyme 一旦被释放，在Perforin 的帮助下会被运送到靶细胞的细胞质中，对靶细胞进行杀伤[23]。值得注意的是，本研究中，采用WB 法检测HLA-G 的表达差异，发现与H8 细胞相比，HLA-G 在C33a及SiHa 细胞中的表达明显升高，且C33a 及SiHa细胞中HLA-G 的表达存在显著性差异。同样的，在经处理的C33a 及SiHa 细胞中NKG2D 的表达差异均有显著性差异，提示HLA-G 作为癌基因，可能与HPV16 感染协同促进肿瘤生成，同时通过抑制NK 细胞表面活化性受体NKG2D 的表达，促进肿瘤免疫逃逸的发生。进一步研究发现，以C33a 细胞为研究对象，HLA-G 基因干扰前后NKP30、Granzyme、Perforin 的表达差异均有统计学意义，而以SiHa 细胞为研究对象，HLA-G 基因干扰前后NKP30、Granzyme、Perforin 的表达差异均无统计学意义。因此，NKP30 能否作为免疫检查点有待课题组进一步研究。

本研究已经在NK 细胞的特性和触发机制的探索方面取得了部分进展，研究的目的是通过靶向NK 细胞受体和癌细胞标记物来触发NK 细胞对癌细胞的溶解反应。研究这些受体的基本作用，对于开发阻碍HLA-G 功能的免疫检查点抑制剂具有重要意义，HLA-G 及其激活性受体NKG2D可能成为肿瘤免疫治疗中免疫阻断的靶点。