HPLC法同时测定乌药叶中4种倍半萜内酯成分的含量

孙崇鲁 章璐幸 俞松林 李士敏

浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100

乌药Linderaaggregate(Sims) Kosterm.系樟科山胡椒属植物，又名矮樟、香桂樟、铜钱柴，主产于浙江、湖南、广西、安徽、广东等地，以浙江省天台县较为著名，称天台乌药，2018年入选新“浙八味”[1]。目前乌药的研究大多集中在其根块的化学成分和生物活性方面，乌药根块提取物具有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗氧化等广泛的活性[2-5]，在中药市场上已被用作治疗药物。但乌药的地下块根生长缓慢，需要8～10年才能达到商品药材的要求。在漫长的生长过程中，乌药茎叶部分资源利用率极低，大部分均被丢弃。然而，在民间医学中，乌药叶常用来治疗急性蜂窝组织炎、臀痈、胃炎以及风湿性关节炎等。历代本草均有记载，乌药叶具有温中燥脾、消食杀蛔的功效，用于治疗腹中寒痛[6]。浙江民间也常用乌药叶入茶饮，有降脂、护肝等保健功效。现代药理学研究表明，乌药叶具有明显的抗氧化、降脂、改善记忆及消炎镇痛等药理作用[7-10]。

课题组前期对乌药叶进行了系统的化学成分研究，从乌药叶的乙醇提取物中分离得到了4个倍半萜内酯类成分，分别鉴定为hydroxylinderstrenolide, 6-acetyl lindenanolide B1 and B2, atractylenolide III, lindenanolide H。结构如图1所示。其中atractylenolide III, lindenanolide H为首次从乌药叶中分离得到。

图1 4种倍半萜内酯的结构图

现代药理学研究[11]表明，倍半萜内酯类具有抗肿瘤、抗疟、抗菌消炎等活性。文献[12]报道atractylenolide III具有抗炎、抗肿瘤、健脾运脾以及促进营养物质吸收等功效，提示倍半萜内酯可能为乌药叶所具主要功效的活性成分。本实验建立HPLC同时测定乌药叶中主要倍半萜内酯类成分含量的方法，为建立全面合理的质量控制和评价标准提供研究基础，并利用此法对10批次不同产地的乌药叶进行测量，以期为今后在乌药叶的开发提供参考数据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 1260高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；AL204电子天平(梅特勒托利多仪器有限公司)。

1.2 材料 对照品 hydroxylinderstrenolide, 6-acetyl lindenanolide B1 and B2, atractylenolide III, lindenanolide H均自制，经ESI-MS，1H-NMR和13C-NMR确认，HPLC测定化合物纯度，归一化法计算纯度>95%。流动相所用乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

不同产地乌药叶经浙江大学新药开发研究中心彭昕教授鉴定为乌药叶Linderaeaggregateleaf，样品信息见表1。上凭证标本存于浙江医药高等专科学校药物研究所。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取一定量的hydroxylinderstrenolide, 6-acetyl lindenanolide B1 and B2, atractylenolide III, lindenanolide H对照品，分别加入适量甲醇超声溶解，使各对照品浓度均为4.0 mg/mL。精密移取各对照品溶液 1.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得各对照品浓度均为0.4 mg/mL的混合对照品储备液，并于4 ℃冷藏保存备用。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取乌药叶粉末约1.0 g于50 mL离心管中，加入50 mL甲醇，超声提取30 min，离心取上清液，重复提取3次，合并上清液，浓缩至干得膏体，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，置4℃冰箱保存备用。使用前取溶液经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件 采用Inertsustain C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～5 min, 10% A→30% A; 5～40 min, 30% A→90% A; 40～45 min, 90%→10% A; 45～50 min, 10% A)，检测波长为210 nm，流速为1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，采用外标法计算含量。在上述条件下，混合对照品溶液及样品溶液的色谱图如图2所示。

注：1. hydroxylinderstrenolide;2. 6-acetyl lindenanolide B1 and B2;3. atractylenolide III; 4.lindenanolide H图2 混合对照品(A)和样品溶液(B)HPLC色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密移取混合对照品储备溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得浓度分别为20、40、80、160、240、320、400 mg/L的混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定hydroxylinderstrenolide, 6-acetyl lindenanolide B1and B2, atractylenolide III, lindenanolide H的峰面积，每个浓度平行测定3次，得到的峰面积取平均值，然后以对照品浓度(mg/L)为横坐标(X)，色谱峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，结果见表2。由相关系数值可知4种倍半萜内酯的浓度与峰面积之间的线性关系良好。

表2 4种标准品的线性方程

2.4.2 精密度试验 取“2.1”项下制备的混合对照品溶液，按“2.3”项下的色谱条件进行HPLC分析，连续进样6次，根据各个对照品的峰面积计算相应的RSD，分别为1.90%、0.64%、0.57%、1.40%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取乌药叶粉末(S-8)约1.0 g，精密称定，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，于 0、2、4、8、12、24 h后分别按“2.3”项下的色谱条件进行HPLC分析，根据4种倍半萜内酯类化合物的峰面积计算相应的RSD，分别为0.87%、1.31%、1.11%、1.14%,表明24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 称取同一产地的样品粉末(S-8)，精密称定6份，每份约1.0 g，分别按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行HPLC分析，根据4种倍半萜内酯类化合物的峰面积计算相应的RSD，分别为1.63%、1.54%、2.00%、2.01%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称定已知4种倍半萜内酯含量的乌药叶样品6份(S-8)，分别精密加入对照品适量，然后按“2.2”项所述的方法制备供试品溶液，按“2.3”项条件进行含量测定，计算4种倍半萜内酯化合物的平均回收率及RSD，结果见表3。4种倍半萜内酯类化合物的平均回收率在96.69%～104.50%，RSD均小于3.0%，表明该方法的回收率良好。

表3 4种倍半萜内酯类化合物的加样回收率试验结果

2.5 样品含量测定 取不同产地的乌药叶粉末约1.0 g，精密称定3份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行HPLC分析，记录各倍半萜内酯的峰面积，根据外标法中的线性回归方程方法计算样品中 4 种倍半萜类成分的含量。结果见表4。

表4 不同产地乌药叶4种倍半萜内酯含量测定结果 (n=3, mg/g)

3 讨论

鉴于倍半萜内酯类为脂溶性化合物，重点考察了几种无水有机溶剂的提取能力，包括乙醇、乙酸乙酯、甲醇、丙酮，结果发现用甲醇做溶剂时所测各指标平均含量较高。同时也考察了提取方法的影响，包括超声提取及加热回流提取，发现两者差异不大。考虑到超声的简便易行，所以选择了超声提取。

试验分别对4个倍半萜内酯的溶液进行了紫外全波长扫描，其最大吸收波长基本上都在210 nm左右，故选择210 nm作为检测波长。另外根据文献[13-15]，分别考察比较了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等多种组合的流动相系统进行洗脱。结果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相在梯度洗脱情况下，所测的4个倍半萜内酯成分分离效果较好，峰形窄而对称。

对于10批次乌药叶含量测定的结果表明，不同产地乌药叶中4种倍半萜内酯成分含量差异很大，这可能与不同种植基地其乌药引种来源以及不同的生态环境有关。从收集的10批次乌药叶中4种倍半萜内酯的总含量来看，来自于浙江和安徽的样品明显优于其它产地。

试验建立了同时测定乌药叶中4种倍半萜内酯的HPLC分析方法，该法简单、准确、重复性好，对于评价乌药叶质量评价具有一定的参考价值。