黔东南产续断多糖提取工艺优化及其抗氧化特性

陈 菊

黔东南民族职业技术学院， 贵州 凯里 556000

续断，为川续断科，多年生草本植物，俗称接骨草、南草、和尚头等，临床上常用于肝肾不足、腰膝酸软、风湿痹痛、跌扑损伤、筋伤骨折、崩漏、胎漏等疾病[1]。贵州是续断的主产区之一，在其东南部境内，常常生于路旁、沟边、田埂及撂荒土地等潮湿处。目前对续断的研究主要是其中的三萜皂苷类、挥发油、生物碱[2-3]等化学成分，续断中还含有多糖成分,有关利用响应面分析法优化续断多糖提取工艺及其抗氧化特性方面的研究鲜见报道。因此，本试验以黔东南产续断为材料，提取续断中的多糖，采用响应面法优化其提取工艺，并在体外测定其抗氧化活性，以期为进一步开发和利用续断资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 续断采自黔东南州境内，洗净，烘干；苯酚、浓硫酸、葡萄糖、1,1-二苯基-2-苦肼自由基(DPPH·)、维生素C、双氧水、硫酸亚铁、水杨酸、无水乙醇、正丁醇、丙酮，分析纯；蒸馏水，实验室自制。

UV8000S紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；MS204S型电子分析天平(精确度0.0001g)，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司)；SYG-6数显恒温水浴锅，常州朗越仪器制造有限公司；EV311旋转蒸发仪，北京莱伯泰科仪器有限公司；DUG-90764型电热鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 续断多糖的提取 续断烘干品，粉粹→粗粉(5 g)，石油醚脱脂2次→以90%乙醇超声提取2～3次→抽滤，弃去滤液，残渣加水，水浴提取→活性炭脱色→减压抽滤→用Sevag法脱蛋白→定容→测吸光度→计算提取率。

1.2.2 续断多糖提取率的测定 精密称取无水葡萄糖对照品0.0116 g,置于100 mL量瓶中,加水适量使溶解,稀释至刻度,摇匀，即得标准溶液(每1 mL中含无水葡萄糖0.116 mg)。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置具塞试管中，并加水补至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，浓硫酸5 mL，摇匀，于水浴中加热15 min，取出，迅速冷却至室温，以蒸馏水作为空白，在490 nm的波长处测定吸光度[4]。以葡萄糖对照品的质量浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线并得出回归方程：A=16.310C-0.075(R2=0.9998)。续断多糖提取率按(1)式计算

(1)

式中：C为续断提取液中多糖的质量浓度，mg/mL；V为续断多糖的定容体积(mL)；N为稀释倍数；W为样品的质量，g。

1.2.3 单因素试验 选取料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g·mL-1))、提取时间(30、60、90、120、150 min)、提取温度(60、70、80、90、100 ℃)和提取次数(1、2、3、4、5次)为单因素，分别依次按照1.2.1进行续断多糖提取的单因素试验。

1.2.4 响应面优化试验设计 在单因素试验基础之上，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，采用4因素3水平响应面分析法对续断中多糖的提取条件进行优化，并对优化条件进行验证。试验因素水平设计见表1。

表1 响应面试验因素及水平表

1.2.5 续断多糖抗氧化活性测定 取适量干燥的续断多糖，配置成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的续断多糖水溶液，备用。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力测定 参考文献[5]的方法稍作修改，准确移取2.0 mL 不同浓度的续断多糖水溶液液于比色管中，加入预先配置好的2.0 mL 2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，摇匀后暗处放置30 min，以样品溶剂为空白，测定其在517 nm 波长处吸光度A，同时测定样品溶液在 517 nm 处的吸光度A0及DPPH 甲醇溶液在517 nm 处的吸光度A1，每个样品重复3 次。清除率计算如(2)式所示。

(2)

1.2.5.2 羟基自由基清除能力测定 参考文献[6]的方法稍作修改，取2.0 mL 不同浓度的续断多糖溶液，依次加入2.0 mL 6 mmol 硫酸亚铁、2.0 mL 6 mmol 水杨酸和2.0 mL 6 mmol/mL 双氧水，混匀后在35 ℃水浴中反应25 min后，在536 nm处测吸光度Ai。以蒸馏水代替双氧水测定吸光值Aj，空白对照以2.0 mL 蒸馏水代替续断多糖溶液测定吸光度A0。清除率计算如(3)所示。

(3)

1.2.6 数据统计分析 单因素试验采用EXCEL、SPSS 22.0进行数据分析，响应面优化试验采用Design-Expert 8.0.6进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对续断多糖提取率的影响 如图1所示，随着料液比的增加，续断多糖提取率逐渐增加，当料液比达1∶25时，提取率达最大，继续增加料液比，提取率反而下降。这是因为液料比较小时，溶剂无法充分浸透，分子扩散速度低，使得提取率较低，随着液料比的增大，溶剂与续断细胞间的浓度差增加，增大了多糖从细胞内部向溶剂主体的扩散系数，使提取率增大，当料液比超过1∶25后，继续增加溶剂，由于溶剂过多，会导致细胞内的其他物质溶出，使提取率下降。因此，最佳料液比选择1∶25。

2.1.2 提取时间对续断多糖提取率的影响 如图2所示，随着提取时间的延长，续断多糖提取率逐渐增大，当达最大值90 min时，提取率达最大，继续延长提取时间，提取率反而下降。其原因可能是提取时间过长，多糖经长时间的高温浸泡，多糖分子结构被破坏，导致提取率下降。因此，最佳提取时间选择90 min。

2.1.3 提取温度对续断多糖提取率的影响 如图3所示，提取温度在60～90 ℃之间，随着温度的升高，续断多糖提取率逐渐增大，当温度到达 90 ℃ 时，提取率达最大值，继续升高温度，提取率反而下降。这可能是温度过高，会导致多糖开始降解，造成提取率下降。因此，最佳提取温度选择90 ℃。

2.1.4 提取次数对续断多糖提取率的影响 如图4所示，当提取次数在2～4之间时，续断多糖提取率变化最为明显，提取次数在3次时，提取率最大，提取次数超过3次以后，提取率逐渐减少。其原因可能是提取次数增多后提取液逐渐粘稠过滤困难，造成损失，导致提取率下降。因此，最佳提取次数选择3次。

2.2 响应优化试验结果与优化分析

2.2.1 回归模型的建立和显著性检测 采用Design-Expert 8.0.6 分析软件，根据Box-Behnken中心组合试验原理设计29个试验，其中4、12、13、22、27 五个试验为中心试验，其余试验为析因试验，结果如表2所示，续断多糖提取率Y为响应值。

由表2，可建立(4)式的四元二次回归方程：

表2 响应面试验设计及试验结果

Y=4.87-0.071A+0.14B+0.093C-0.17D+0.052AB-0.012AC-0.12AD-0.047BC-0.1BD+0.11CD-0.26A2-0.14B2-0.47C2-0.22D2

(4)

由表3、表4可知，该回归模型P<0.0001，说明该二次方程模型为高度显著，而失拟项不显著(P=0.1532<0.05)，说明方程拟合效果好，CV%=3.29表明试验的可信度和精确度高。因此，可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。通过对回归方程进行显著性分析可知，二次项B2与C2达高度显著，二次项A2、D2及一次项B、D均达极显著，交互项AB、AC、AD、BC、BD、CD对续断多糖提取率均不显著。因此，各因素对续断多糖提取的影响顺序从大到小依次为提取温度、提取次数、提取时间、料液比。根据四元二次回归模型，在所选取的各工艺条件范围内，由软件分析得到提取续断多糖的最佳条件为：料液比1∶24.78、提取温度90.62 ℃、提取时间 91.8 min、提取次数2.62次，此条件下多糖提取率理论上为4.91%。根据实际操作要求，选取最佳提取工艺条件为料液比1∶25、提取温度91 ℃、提取时间90 min、提取次数3次、试验重复3次，得到提取率为4.74%，与理论值接近，由此得出该续断多糖提取工艺条件具有较好的稳定性和可操作性。

表3 回归模型方差分析

表3 回归模型方差分析

表4 回归模型的可靠性分析

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 清除DPPH自由基(DPPH·)能力测定 续断多糖清除DPPH自由基能力如图5所示。在续断多糖质量浓度0.2～1.2 mg/mL范围内，随着续断多糖质量浓度增加，清除DPPH自由基能力增强。当质量浓度为0.8 mg/mL时，清除能力最强，达到93.9%，相同浓度下VC的清除率为105.9%，说明续断多糖具有较强的清除DPPH自由基能力。

2.3.2 清除羟基自由基(·OH)能力测定 续断多糖清除羟基自由基能力如图6所示。在续断多糖质量浓度0.2～1.2 mg/mL范围内，随着续断多糖质量浓度增加，清除羟基自由基能力增强。当质量浓度为0.6 mg/mL时，清除能力最强为68%，说明续断多糖具有较强的清除羟基自由基能力。

3 讨论

张丹等[7]运用正交试验设计提取渝产续断中的多糖，结果表明在料液比为1∶20(g·mL-1),提取时间60 min，提取4次的最佳工艺条件下，续断多糖的平均提取率为7.47%，但并没有将试验中的各因素与指标的相互关系进行拟合，建立数学模型。本研究在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken试验设计及响应面分析法，得出影响续断多糖提取的因素顺序为提取温度﹥提取次数﹥提取时间﹥料液比，并建立提取续断多糖的回归模型方程为：

Y=4.87-0.071A+0.14B+0.093C-0.17D+0.052AB-0.012AC-0.12AD-0.047BC-0.1BD+0.11CD-0.26A2-0.14B2-0.47C2-0.22D2

通过对提取工艺中的参数进行优化得到最佳提取条件为：料液比1∶25( g·mL-1)、提取温度91 ℃、提取时间90 min、提取3次，在该条件下续断多糖提取率为4.74%。此法比正交试验设计直观，试验精度高，还提高了试验的预测性，具有较好的实用价值。

DPPH自由基是一种稳定的有机自由基，对DPPH自由基的清除率可以作为评价物质抗氧化活性的指标之一[8]。羟基自由基毒性极强，可对生物膜造成损伤，导致多种疾病发生，清除体内羟基自由基是确保机体健康必不可少的需求[9]。将本试验中最佳提取条件下的多糖提取液进行抗氧化试验，发现其具有较强的清除DPPH自由基、羟基自由基的能力，说明续断具有良好的体外抗氧化活性。因此，该研究为续断资源在抗氧活性方面的研究提供理论参考依据。