三苯基锡和聚苯乙烯微塑料联合暴露对大鳞副泥鳅的急性毒性效应

王 伟，王亚军，李立杰，沈子伟，倪朝辉，谭凤霞，柴 毅

(1.长江大学湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北荆州 434025；2.长江大学农学院，湖北荆州 434025；3.长江大学动物科学学院，湖北荆州 434025；4.中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部长江中上游渔业资源环境科学观测实验站，武汉 430223)

三苯基锡(triphenyltin,TPT)是一类重要的有机锡化合物，具有较强的杀菌能力，常被作为农业杀菌剂而被广泛应用，由于其过量使用导致土壤中浓度较高，并可能通过地表径流进入水环境，从而造成水域生态环境污染。TPT还可用于船舶的防污涂料，这也是其在水环境中较高浓度的主要原因之一。有研究表明我国水域中TPT的污染状况已十分严重，据报我国厦门近海环境中的TPT浓度为2.2～160 ngSn/L，嘉陵江段水体中的TPT浓度也已高达37.2 ngSn/L，长江流域三峡库区受到有机锡污染的最大浓度为393.35 ngSn/L。水环境中较高浓度的TPT除了对各种水生生物可能产生直接危害外，还可进一步通过食物链被放大，使整个水域生态系统面临更严重的风险。有研究表明，TPT可显著降低中华鲟的产卵量和产卵率，诱发中华鲟()幼体畸形，是导致中华鲟物种退化的主要原因之一。对斑马鱼()的系列研究表明，TPT暴露可引起其生长抑制、视力衰退、氧化应激和甲状腺分泌紊乱等不良影响。

国际上将粒径≤5 mm的塑料颗粒定义为微塑料(microplastics,MPS)，主要是由较大的塑料碎片在生物降解、光降解以及物理磨损等作用下分解产生的，属于新型污染物，已引起人们极大的关注。由于塑料价格低廉、经久耐用和携带方便等优点，被广泛应用于工农业生产及日常生活中，而造成的塑料废弃物导致水环境中积累的MPS浓度正在持续增加。有数据表明，沿海港口水域通常是MPS的聚集区域，瑞典港口地区海水中的MPS浓度已达到100 000个/m，在英国添马舰港口检测的MPS丰度占全部碎片的65%，在中国长江口地区和三峡库区也发现了微塑料污染，其丰度分别为(4 137.3±2 461.5) 个/m和1 597～12 611个/m。已有多项研究对MPS的毒性作用机制进行了研究。结果表明，聚苯乙烯微塑料能够在斑马鱼腮、肠以及肝脏组织中积累，并诱导氧化胁迫，扰乱鱼体的脂质和能量代谢，引起炎症反应。MPS由于其尺寸小，比面积大，吸附能力强，也可成为其他环境污染物的载体并与之相互作用。MPS在联合毒性实验中表现出对染毒物质不同的调节作用，如MPS和三苯基锡联合暴露会延缓胭脂鱼()的死亡时间、与铜联合暴露促进了铜在斑马鱼肝脏和肠道组织中的积累，加重了肠道和肝脏中的毒性，表现为丙二醛(MDA)和金属硫蛋白(MT)水平升高，超氧化物歧化酶(SOD)水平下降，与菲联合暴露加剧了斑马鱼氧化应激以及相关抗氧化基因的表达量。因此MPS和环境污染物联合作用值得关注。

大鳞副泥鳅()是一种小型底层杂食性鱼类，适应性强，栖息范围广，对化学药物敏感，易于在实验室养殖，是较为理想的水生生物实验材料。目前已有多种水产药物对大鳞副泥鳅毒性试验相关研究。本实验通过研究三苯基锡单独暴露和与微塑料联合暴露对大鳞副泥鳅的急性毒性效应，通过半致死浓度(LC)、安全浓度(SC)、药物蓄积程度系数(MAC)和不同时间段的死亡率来分析三苯基锡对大鳞副泥鳅的毒性变化规律以及聚苯乙烯微球与三苯基锡的联合毒性效应，为水环境保护及污染治理提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

大鳞副泥鳅由荆州市渔都特种水产养殖公司提供，挑选规格一致[体重(0.097±0.013) g，体长(2.03±0.15) cm]、体质健康的个体进行实验。实验开始前暂养一周，暂养水箱长0.7 m，宽0.5 m，暂养水体pH 7.5，溶解氧≥6.5 mg/L，水温(20±1) ℃，光照周期设置为14 h光照:10 h黑暗。每天正常喂食，日投喂量为1.5%。暂养水每24 h更换。正式实验开始前24 h停止喂食。

1.2 暴露液配制

将TPT(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶于二甲基亚砜(天津市科密欧化学试剂有限公司)配制成1 g/L的母液，避光4 ℃保存，实验前再根据浓度设置梯度用蒸馏水稀释到所需浓度。

聚苯乙烯微球(无锡瑞格生物科技有限责任公司)粒径为200 nm，密度为1.05 g/cm，变异系数(CV)<6%，乙醇中溶胀率为5%～10%，微球电镜形貌如图1所示，实验前用蒸馏水稀释到所需浓度。

图1 聚苯乙烯微球形貌表征Fig.1 Morphology characterization of polystyrene microspheres

1.3 实验方法

通过预实验，观察96 h内大鳞副泥鳅的死亡情况，得出24 h全部死亡的最低浓度和96 h全部不死亡最高浓度。根据预实验的结果来设置正式实验TPT的浓度梯度。

1.3.1 TPT急性毒性实验

根据预实验结果按等对数间距设置6个浓度梯度(表1)，每浓度组10尾实验鱼，设3个平行组，1个空白对照组。采用半静态方式水生生物急性毒性实验法，实验期间不投喂，为保证实验暴露液的浓度，每隔24 h更换暴露液一次。实验开始后12 h连续观察实验鱼的运动情况并记录，在24、48、72、96 h观察死亡情况并及时清出死亡个体。

表1 TPT的浓度梯度Tab.1 The concentration of TPT

1.3.2 TPT和聚苯乙烯联合毒性实验

在LC实验基础上，每个TPT浓度组与聚苯乙烯微球溶液(1 mg/L)联合对实验鱼进行96 h急性毒性实验。每个浓度组设置三个平行，一个空白对照组。

1.4 数据处理

采用寇式法(Karber)计算LC、SC和LC的95%置信区间(CI)，利用MAC来分析实验鱼体内对药物的蓄积、降减变化。采用检测比较TPT与TPT+聚苯乙烯处理下实验鱼存活情况是否存在差异，当<0.05时认为差异显著，<0.01时差异极显著。相关计算公式如下：

LogLC=-(∑-05)；

SC=48 h LC×0.3/(24 h LC/48 h LC)；

95%CI=LogLC±1.96×[∑(pg/n)]；

MAC=100%×(LC-LC)/(LC-LC)，

公式中:为消毒剂最大浓度的对数，为相邻浓度的对数差值，为死亡率(%)，∑为各组死亡率之和，为存活率()，为每组实验鱼的尾数，LC和LC为观察时段和的半致死浓度值(mg/L)，LC和LC分别为实验初始、结束时半致死浓度(mg/L)。

2 结果

2.1 TPT单独暴露对大鳞副泥鳅的急性致死效应

实验开始6 h后，TPT高浓度组(Ⅴ和Ⅵ)实验鱼开始出现明显应激反应，表现为易受惊扰，急促不安地上下游动，游动迅速。中低浓度组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)未出现明显应激反应，游动平缓，活动范围小。8 h后高浓度组的实验鱼游动减缓且身体失衡，漂浮在水面上方，随着染毒时间延长，身体倾斜，游动减少，最终沉至水底静止不动直至死亡。

如表2所示，在96 h的急性毒性实验中对照组的实验鱼均未发生死亡，TPT处理组实验鱼的死亡率均随药物浓度升高，实验时间延长而上升。低浓度组(Ⅰ)的TPT对大鳞副泥鳅的急性致死效应最小，中高浓度组(Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)的TPT对大鳞副鳅的急性致死效应较大，且72、96 h中高浓度组的死亡率均为100%。

表2 大鳞副泥鳅在三苯基锡作用下的死亡率Tab.2 The mortality of P.dabryanusexposed to triphenyltin

2.2 LC50和毒性蓄积效应

24、48、72和96 h的LC、CI、MAC和SC结果如表3所示。TPT对大鳞副泥鳅24、48、72和96 h的半致死浓度LC分别为0.086、0.037、0.026、0.019 mg/L，安全浓度SC为0.002 mg/L，药物蓄积程度系数MAC 随实验时间延长而下降，且下降较快。

表3 三苯基锡对大鳞副泥鳅的半致死浓度、药物毒性蓄积程度系数和安全浓度Tab.3 LC50,MAC and SC of the triphenyltin in P.dabryanus

2.3 TPT与聚苯乙烯联合的毒性效应

如图2所示，由TPT单一毒性实验结果可知，实验鱼的死亡率均随药物浓度升高，实验时间延长而上升。低浓度组(Ⅰ)的TPT对大鳞副泥鳅的急性致死效应最小，中高浓度组(Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)的TPT对大鳞副泥鳅的急性致死效应较大，且中高浓度组(Ⅳ、Ⅴ)的TPT分别在暴露了72 h和48 h后诱导了大鳞副泥鳅100%的死亡率。而在与MPS联合的情况下，低浓度组(Ⅱ、Ⅲ)的72 h和96 h的死亡率显著下降，中高浓度组(Ⅳ、Ⅴ)100%的死亡率只有在暴露了96 h和72 h之后才能记录到，中高浓度组(Ⅳ、Ⅴ)100%死亡率较单一毒性结果均有延迟，低浓度组(Ⅰ)和高浓度组(Ⅵ)无显著变化。表明MPS对TPT的毒性效应具有延缓作用。

图2 三苯基锡与聚苯乙烯联合对大鳞副泥鳅的死亡率比较Fig.2 Comparison of mortality between triphenyltin and polystyrene on P.dabryanus不同小写字母(a,b,c,d)表示同一时间点不同处理组之间的差异显著(P<0.05)

2.4 三苯基锡和聚苯乙烯联合暴露的半致死浓度

如表4所示，TPT和MPS联合暴露对大鳞副泥鳅24、48、72和96 h的LC分别为0.087、0.065、0.041、0.025 mg/L，与TPT单独暴露相比，联合暴露48、72和96 h的LC均增大，表明MPS能够抑制TPT的毒性，表现为拮抗作用。

表4 三苯基锡和聚苯乙烯微塑料对大鳞副泥鳅的半致死浓度Tab.4 LC50 of triphenyltin combined with polystyrene on P.dabryanus mg/L

3 讨论

3.1 三苯基锡对水生生物的毒性效应研究

LC是评价污染物对水产动物急性毒性的重要指标，根据鱼类急性毒性实验的96 h LC，有毒物质对鱼类的毒性作用分为4级:<0.1 mg/L，剧毒;0.1～1 mg/L，高毒;1～10 mg/L，中毒;>10 mg/L，低毒。林华兵等研究发现三苯基锡对羽摇蚊()幼虫、小锥实螺()、颤蚓()的24 h LC分别为278.7、249.1、287.8 μg/L，颜天等测得三苯基锡对糠虾()24 h LC为0.025 μg/L。这些结果都表明低浓度的三苯基锡对水生生物具有很强的毒性。其中王庆伟和张潇峮等研究发现，三苯基锡对斑马鱼(var)的96 h LC为0.012 mg/L，对胭脂鱼()幼鱼的96 h LC为0.017 mg/L，而本研究显示三苯基锡对大鳞副泥鳅的96 h LC为0.019 mg/L，结果非常接近，可见三苯基锡对鱼类是剧毒物质，三苯基锡污染会对水生生物产生巨大危害。

MAC常作为生物对毒物敏感程度的指示参数，来分析毒物在生物体内的蓄积和降解情况，当MAC为正值时，蓄积作用强于降解作用，MAC为负值时，降解作用强于蓄积作用，MAC值越大，即毒效蓄积程度越大，生物抗毒能力下降致死率越大，反之亦然。已有研究表明，探讨污染物对生物毒性的毒性效应时，应分析毒物蓄积变化，来全面评估污染物的毒性效应。本实验通过比较三苯基锡MAC值，发现24～48 h段的MAC值最大，表明此时间段内毒性的蓄积作用远大于降解作用，即死亡高峰段。而后随着时间的延长，MAC值下降明显，48～72 h的MAC值是24～48 h的22.9%，72～96 h的MAC值是48～72 h的54.9%，说明随着暴露时间的延长，大鳞副泥鳅的降解毒效能力增强，毒效蓄积速度下降，表明大鳞副泥鳅对三苯基锡敏感性强。

3.2 微塑料与水环境污染物联合的毒性效应

众多研究表明，微塑料能够与环境污染物相互作用。KIM等研究了两种微塑料与镍(Ni)对大型溞()的毒性作用，与镍单一毒性相比，发现微塑料对镍毒性有轻微的拮抗作用。KHAN等研究发现微塑料显著降低了斑马鱼对银(Ag)的摄取，也显著增加了肠道Ag的比例。这些结果表明不同的微塑料对不同的环境污染物的吸附能力不同，这与它们表面的性质特征有关。这种吸附可能改变水生生物对环境污染物的利用度和吸收途径，从而改变其毒性效应。OLIVEIRA等研究表明，微塑料的存在延缓了芘诱导鰕虎鱼()的死亡时间，芘单独暴露，发现最高浓度的芘(200 μg/L)在48 h诱导了100%的死亡，而与微塑料联合暴露，只有在60 h后才能记录到100%的死亡率。本研究三苯基锡与聚苯乙烯联合暴露研究也发现中高浓度组(Ⅵ，Ⅴ)100%的死亡率较三苯基锡单一毒性结果均有延迟且48、72和96 h的半致死浓度LC均增大，表明微塑料对三苯基锡的毒性具有一定的调节延缓作用。微塑料的存在推迟了大鳞副泥鳅的致死时间，但没有保护其免受死亡，其原因可能是:(I)联合暴露所涉及的机制是短暂的，只能维持相对较短的时间;(Ⅱ)保护机制只能应对一定水平的三苯基锡浓度，高于这一阈值水平就会造成严重的毒性影响，导致死亡。这种联合作用机制很复杂，需进一步研究微塑料和三苯基锡联合对大鳞副泥鳅的影响，特别是长期暴露于微塑料和三苯基锡的情况下，研究微塑料对三苯基锡的吸附能力，以及三苯基锡在大鳞副泥鳅不同组织部位的积累，从分子水平上来分析这种联合毒性效应。