分子标记辅助绥芬河珠星三块鱼提纯复壮

赵雪飞，黄 晶，李 乾，梁利群，孙 博，张立民，王维坤，常玉梅

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，哈尔滨 150070；2.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨 150040； 3.江苏海洋大学，江苏省海洋生物资源与环境重点实验室，江苏连云港 222005；4.黑龙江省东宁市水产局，黑龙江东宁 157200)

三块鱼()是鲤形目鲤科雅罗鱼亚科三块鱼属几种土著经济种的统称，主要分布于太平洋西北部的日本海及一些内陆淡水河流，包括俄罗斯的滨海省、哈巴洛夫斯克和萨哈林，日本及朝鲜半岛，在我国仅分布于绥芬河和图们江流域。三块鱼是传统的珍稀名贵鱼类，肉质细嫩、肉味鲜美，其中所含的蛋氨酸和赖氨酸等人体必需氨基酸较一般鱼类含量高，同时含有丰富的不饱和脂肪酸和维生素A、维生素D等。历史上，三块鱼与兴凯湖的大白鱼和乌苏里江的鲑并称为“边塞三珍”。

近年来，由于水域环境遭到破坏，加之污染和酷捕滥捞等人为因素，洄游至我国的三块鱼资源濒临枯竭，由曾经的几十万尾到目前的几千尾。为增加三块鱼的野生种群数量，自1989年以来，黑龙江省东宁市水产局通过捕捞洄游产卵群体，采集精卵，实施人工授精和苗种孵化的方式，补充三块鱼野生资源。早期三块鱼洄游产卵群体因婚姻色差异和洄游时间的不同被划分为3个群体，俗称“金滩头”、“银滩头”和“黑滩头”。近年来，我国学者从解剖学、生化及DNA分子标记等多个角度证实，洄游到我国绥芬河产卵的只有2个种群，即俗称“金滩头”的珠星三块鱼()和俗称“黑滩头”的三块鱼()；而“银滩头”实际上是珠星三块鱼、三块鱼及二者少量的杂交个体组成的一个混合群体。

珠星三块鱼和三块鱼表型相近，不易区分，只有在性成熟时，依据洄游时间和婚姻色进行区分，因此极易造成种质混杂。近期研究团队在结合表型鉴定和分子标记检测两种技术判定时就发现，珠星三块鱼种质混杂严重，一些个体在表型和基因组层面都出现了三块鱼特有的表型特征和基因痕迹。因此，为保护这一珍贵种质资源，本研究采用了“表型+基因型”相结合的辅助选育技术，对珠星三块鱼野生原种连续两代进行鉴定，并对比选育和未选育F代生长性状，以期获得提纯的优质珠星三块鱼种质，为科学指导珠星三块鱼的增殖放流，确保其种质的纯正及天然野生资源的可持续利用提供保障。

1 材料与方法

1.1 实验鱼来源及表型鉴定

依据珠星三块鱼的洄游时间，2014年4月下旬，从黑龙江省东宁市绥芬河捕捞洄游产卵的珠星三块鱼野生亲鱼，分别采集精卵进行人工授精，然后将约3万粒受精卵带回至黑龙江水产研究所室内养殖车间进行孵化桶流水孵化，获得鱼苗约6 000尾，经开口驯化后转至黑龙江水产研究所呼兰实验站室外土池(0.2 hm)培养至4龄性成熟。体色鉴别发现这批珠星三块鱼出现两种体色特征，一种是珠星三块鱼特有体色特征，体侧为三条红线(侧线鳞，侧线鳞上、侧线鳞下)，记为珠星三块鱼野生原种；另一种则为三块鱼特有体色特征，体侧为单条红线(侧线鳞下，图1)，记为珠星三块鱼变异种。分别选取93尾颜色纯正的原种和69尾变异种进行电子标记，并剪取鳍条进行mtDNA和核DNA检测。

图1 珠星三块鱼原种及变异种Fig.1 Wild broodstocks and its variants of T.hakonensis

1.2 线粒体DNA COI基因鉴定

DNA提取和线粒体基因引物信息及扩增方法等参考常玉梅等的报道。具体来讲，采用线粒体通用引物(F:5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′；R:5′-TAGACTTCTGGG TGGCCAAAGAATCA-3′)对珠星三块鱼野生原种及其变异种共162尾个体进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL，其中包含自制PCR buffer mix 18μL(50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl、0.10%TritonX-100、1.5 mmol/L MgCl、0.10%NP-40、0.01%明胶、200 μmol/L 4种dNTP)，浓度10 μmol/L的上下游引物各1 μL，DNA聚合酶0.2 μL(Fermentas,5 U/L)，模板DNA 2 μL，去离子灭菌水补至总体积25 μL。PCR反应程序为95 ℃预变性3 min；35个循环包括95 ℃ 15 s，57.7 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；最后72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送至北京诺赛基因公司进行测序。

从GenBank数据库中下载俄罗斯滨海区珠星三块鱼(isolate Vkk，EU392224.1)和三块鱼(EU392229.1)特有的单倍型序列，然后与本研究中的162条序列合并后采用邻接法(Neighbor-Joining)构建基于Kimura双参数模型(Kimura 2-parameter,K2P)的单倍型进化树，并经1 000次自展检验(Bootstrap)。选用草鱼()基因相应片段(NC_010288.1)作为系统进化分析的外类群。

1.3 种质特异DNA分子标记鉴定

为了避免mtDNA因母性遗传特征而无法高效鉴定杂交种的问题，本研究采用前期已鉴定的三块鱼种质特异性核DNA(Microphthalmia-associated transcription factor a)基因继续对已完成基因鉴定的珠星三块鱼野生原种进行种质鉴定。同时，根据常玉梅等和赵雪飞等报道的已用分子标记鉴定过的珠星三块鱼和三块鱼野生鳍条样本(各2尾)作为对照。基因引物信息及扩增方法参照赵雪飞等的报道。具体来讲，采用基因引物(F：5′-CTGGGGTTGACAAAGAATGGT-3′；R：5′-TGGTGTGTTCGTTTCTGCTG-3′)对88尾珠星三块鱼野生原种进行PCR扩增，PCR反应体系同基因扩增体系，PCR反应程序为95 ℃预变性3 min；35个循环包括95 ℃变性15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；最后72 ℃延伸10 min。

1.4 分子标记辅助珠星三块鱼原种扩繁

将表型和基因型(线粒体DNA基因型及核DNA基因型)鉴定均为珠星三块鱼野生原种的4+性成熟个体，于2019年5月28日进行人工催产和授精，获得自交F。随机抽取30尾子代样本和30尾亲本，进行线粒体DNA基因及核DNA基因双重鉴定，确定子代种质纯正。

1.5 提纯子代与未提纯子代生长对比

为了观察提纯子代是否存在生长衰退现象，本研究进行了提纯子代及未提纯子代生长对比实验。首先将2 600尾提纯子代及未提纯子代于2019年6月5日分别投放至黑龙江水产研究所呼兰实验站两个0.08 hm室外土池进行分塘饲养，越冬前(4月龄)分别测定体重和体长；然后剪鳍标记后分别挑选1 500尾进行并塘越冬(0.2 hm土池)，次年继续同塘饲养28个月，每年10月初(16月龄和28月龄)随机打捞两种实验鱼分别测定体重和体长。采用Student′s t-test分别评估同一采样时间点内提纯子代和未提纯子代的体重和体长差异，显著性设定为<0.05，所有数据采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 珠星三块鱼野生原种及其变异种线粒体COI基因鉴定结果

将4龄珠星三块鱼野生原种及其变异种共计162尾个体的基因扩增序列进行比对处理，得到有效序列长度为633 bp。单倍型检测发现，162尾个体共检测到4种单倍型(图2)，其中Hap3为主效单倍型，有144尾个体共享，其余3种单倍型，只有5～7尾个体共享(表1)。系统进化树显示，珠星三块鱼原种的两个单倍型Hap3和Hap4与俄罗斯的珠星三块鱼聚为一支；而珠星三块鱼变异种特有的两个单倍型Hap1和Hap2与俄罗斯的三块鱼聚为一支(图3)。

图2 COI基因在珠星三块鱼野生原种及其变异种中的4种单倍型Fig.2 Four haplotypes of COI gene in wild broodstocks and its variants of T.hakonensis

图3 珠星三块鱼野生原种及其变异种单倍型系统进化NJ树Fig.3 Neighbor-Joining tree of haplotypes in wild broodstocks and its variants of T.hakonensis

表1 珠星三块鱼野生原种及其变异种的单倍型检测结果Tab.1 The number of haplotypes in wild broodstocks and its variants of T.hakonensis

2.2 珠星三块鱼野生原种核DNA mitfa基因鉴定结果

将单倍型为Hap3的88尾珠星三块鱼原种挑选出来，进一步利用种质特异性DNA标记基因进行核基因组基因污染检测。结果显示单倍型为Hap3的人工养殖的珠星三块鱼野生原种个体均扩增出与野外采集的珠星三块鱼一致的条带，并未出现三块鱼特有的DNA谱带(图4)。

图4 单倍型为Hap3的珠星三块鱼特异的mitfa基因型Fig.4 Specific mitfa genotypes of T.hakonensis with Hap3M为DNA marker 2000；序号1-20为珠星三块鱼原种部分个体

2.3 分子标记辅助珠星三块鱼原种扩繁及子代提纯鉴定结果

经线粒体DNA和核DNA双重分子标记鉴定的88尾原种个体(37♀，51)进行人工催产，结果有55尾个体(25♀，30)繁殖成功。受精卵孵化出F子代鱼苗后，随机选取30尾F子代与30尾亲本共同进行和基因双重鉴定。基因鉴定结果显示，所有子代与亲代均为单倍型Hap3(图2)；基因鉴定结果显示，F子代扩增条带类型与亲代保持一致，均为珠星三块鱼野生种特有基因型(图5)。

图5 单倍型为Hap3的珠星三块鱼原种亲本及其子代特异DNA谱带Fig.5 Specific DNA bands of original parents and their offspring of T.hakonensis with Hap3 haplotypeM为DNA marker DL2000；亲本为珠星三块鱼原种的亲本；子代为提纯的F1子代

2.4 提纯子代生长性状测量结果

提纯子代和未提纯子代池塘生长对比结果显示(表2)，分塘饲养至4月龄和并塘饲养至16月龄时二者体重和体长均无明显差异。但同塘饲养至28月龄时，提纯子代平均体重已增至(256.62±23.28) g，而同龄未提纯个体平均体重仅为(217.78±29.39) g，其生长速度显著低于提纯子代。

表2 珠星三块鱼提纯子代与未提纯子代生长对比情况Tab.2 Growth comparison between purified offspring and unselected offspring of T.hakonensis

3 讨论

自上世纪80年代起，就有学者对三块鱼(早期称之滩头雅罗鱼)的种群生物学和繁殖生物学特性等开展了相关研究。目前虽然已经能够对人工养殖的两种三块鱼野生种实现全人工繁殖，但由于珠星三块鱼与三块鱼仅能通过洄游时间和体表的婚姻色进行区分，且野外产卵场地重叠，国内外学者均在野外发现有杂交个体，因而种群存在种质混杂现象。

种质鉴定是水产动物种质资源评估、开发及利用的重要基础。近年来，随着生物技术的发展，分子标记技术避免了常规表型鉴定时可能存在的误差，是目前对种质资源进行更为合理、准确鉴定的重要技术手段。线粒体基因作为物种鉴定的有效基因，因其在不同物种的保守性存在很大差异，被广泛用于不同种间的种质鉴定。利用该技术，国外学者成功地将三块鱼属的不同种及地理群体进行了划分。常玉梅等同样利用该技术，明确了我国绥芬河珠星三块鱼和三块鱼的分类地位。但是由于线粒体DNA的母性遗传特性，对存在基因渐渗的群体的鉴定存在偏差，而核DNA分子标记技术则能有效弥补线粒体DNA母性遗传的不足。因此，国内外学者在区分珠星三块鱼和三块鱼时均选择采用“mtDNA+核DNA”的两种基因标记鉴定方法来综合判定。

为了检验珠星三块鱼种质是否纯正，本研究在原有的“mtDNA+核DNA”鉴定方法基础上与表型鉴定方法相结合进行三重鉴定。首先依据表型特征将其划分为野生原种和变异种，随后利用基因成功地将162个个体划分到两个类群，即93个原种个体和56个变异种个体聚类到珠星三块鱼分支，剩余13个变异种个体则聚类到三块鱼分支，说明2014年引进的珠星三块鱼野生群体确实出现了种质混杂(表2，图3)，推测这些个体可能是以三块鱼为母本，珠星三块鱼为父本的杂交后代。POLYAKOVA等和SAKAI等曾发现珠星三块鱼在野外常与分布于北海道的三块鱼杂交(10-20%的野生后代是杂种)，且通常三块鱼多为母本参与杂交(85%)，这与本研究结果是一致的。除天然杂交外，不科学的增殖放流也可能是造成珠星三块鱼种质混杂的另一主要原因。

从表型鉴定和基因型鉴定结果可以看出珠星三块鱼种质混杂比较严重，162尾个体中有69尾个体都出现了不同程度的混杂。分子标记辅助选育可加快具有特定优良性状的品种的选育速度，广泛应用于鱼类的遗传改良。孙效文等利用与体重相关的分子标记进行品种培育，建立了综合性状好、生长速度更快的镜鲤()新品系；FUJI等利用一个与抗淋巴囊肿病相关的微卫星标记9-8辅助牙鲆()繁育，其后代未爆发淋巴囊肿病，而对照组有4.5%～6.3%的发病率。但利用分子标记技术进行种质提纯鲜有报道。本研究利用“表型+基因型”逐级递进的检测技术成功地对珠星三块鱼野生原种进行了种质提纯。连续两代检测结果中单倍型均为野生珠星三块鱼特有单倍型Hap3，核DNA扩增谱带为野生珠星三块鱼特有基因型，无论线粒体DNA还是核DNA均未出现分化，表明珠星三块鱼提纯效果佳。另外，通过池塘生长对比，发现经过分子标记辅助选育的F子代平均体重显著高于同龄的未选育子代(表2)，表明提纯F代具有良好的生长性状。

珠星三块鱼需4龄才能达到性成熟，采用传统的表型选择的方法进行提纯复壮，周期过长，而且不能保证种质纯正。如果采用本研究的“表型+mtDNA+核DNA”三重鉴定辅助选育技术，则可以克服传统选育方法中的弊端，大大提升珠星三块鱼种质的提纯速度，有效缩短选育周期，提高提纯复壮效率，为珠星三块鱼野生种质资源的恢复、保护及合理利用提供技术支撑和种质保障。