冻融循环对熟制鲣鱼暗色肉脂质变化的影响

楼丹露，王清政，邹祖全，谷贵章，胡奇杰，张进杰，徐大伦,*

（1.宁波大学食品与药学学院，浙江 宁波 315800；2.宁波大学医学院，浙江 宁波 315800；3.湖州食品药品检验研究院，浙江 湖州 313000）

鲣鱼俗称炸弹鱼，属金枪鱼科、鲣属，其营养物质含量丰富，是符合人体健康的理想食品。鲣鱼产量约占世界金枪鱼总产量的48%以上，且目前鲣鱼的捕捞量相对较稳定，在未来捕捞量还可能有所上升。鲣鱼的可食部位可分为白色肌肉组织和暗色肌肉组织，白色肉的外观、营养、质地及口感较优，可加工成鱼肉罐头、鱼松、鱼片等直接食用。而暗色肉因为腥味重、肉色暗红且具有不良的口感，因此不易被人接受，但暗色肉作为鲣鱼的副产品，富含二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等多不饱和脂肪酸，还含有丰富的血红素铁，能满足不同人群的营养需求。因此，暗色肉被大多数鲣鱼加工企业作为二次加工的原料，这也促进了对鲣鱼副产品资源的合理利用。

冷冻是目前长途运输、贮藏及销售过程中保证水产品品质的重要手段。但现如今我国冷链技术管理尚不完善，冷冻水产品在长途贮运过程中受环境温度波动影响会出现反复冻融的现象。冻融会使小冰晶融化并随后形成更大且更不规则的晶体，冰晶的生长会给肌肉组织造成不可逆的机械性损伤，致使水产品细胞破裂，促氧化物质（血红素铁）释放，加速脂质氧化分解、蛋白质劣变。Wang Bo等发现在冻融过程中，冰晶体和重结晶的形成会破坏猪肉馅饼肌肉组织，加速脂质氧化反应以及诱导丙二醛的形成。Yu Manman等研究发现在脂肪酶和脂氧合酶的作用下，海螺在冷藏期间会发生脂质的水解和氧化。合理的脂质氧化会赋予食品特有的风味，然而过度氧化会使脂肪酸进一步分解成一些醛、酮、酸类小分子化合物，导致产品酸败劣变，影响产品风味。熟制鲣鱼暗色肉作为二次加工的原料，在加工前有一个长途运输、贮藏的过程，因此会不可避免地产生反复冻融的现象，致使暗色肉在冻融循环过程中脂质发生变化。

本实验旨在以熟制鲣鱼暗色肉作为原料模拟长途运输、贮藏过程中的冻融循环，研究冻融循环过程中暗色肉的脂质组成、脂肪酸组成以及脂质氧化程度的变化，并进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和相关性分析，探究冻融循环-脂质组成-脂质氧化程度三者之间的相关性规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

熟制鲣鱼暗色肉块 宁波凯创冷冻食品有限公司。

甘油三酯（triacylglycerol，TAG）试剂盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；三氯乙酸、冰乙酸、硫代硫酸钠、甲醇、氢氧化钾、乙醚、异丙醇、酚酞、碘化钾、氯化钠、正己烷、乙酸、氯仿、三氟化硼、硝酸、高氯酸、钼酸钠、氧化锌、盐酸、硫酸联氨、磷酸二氢钾、浓硫酸、吡啶、正庚烷、乙酸铜、油酸等（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2550紫外-可见分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；DocuMeter pH计 德国Sartorius 公司；RV-10型旋转蒸发仪 德国IKA公司；7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；BCD-539WL冰箱青岛海尔股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冻融循环处理

在聚苯乙烯泡沫箱中装入碎冰，将熟制鲣鱼暗色肉块（每块约500 g）置于碎冰中并在3 h内运至实验室。将肉块切分为9 cm×3 cm×3 cm的长方体，然后用聚氯乙烯袋（17 cm×23 cm）分装，每袋分装质量约50 g。分装后一部分用于对照组（未经过冻融循环处理）的指标测定，另一部分用于冻融循环处理。

冻融循环处理参考文献[5]的方法并稍作修改，取分装好的暗色肉样品放入-20 ℃冰箱中冷冻贮藏5 d，取出后于4 ℃冰箱中解冻12 h，作为1 次冻融，再放回-20 ℃下进行冷冻贮藏，重复上述步骤，共冻融8 次，并在冻融2、4、6、8 次后取样测定相关指标。

1.3.2 pH值的测定

pH值的测定参照文献[9]的方法并稍作修改，取2 g样品，加入18 mL去离子水，25 000 r/min均质1 min，静置30 min后冷冻离心（4 ℃、1 000 r/min、10 min），取上清液用pH计测定pH值。

1.3.3 过氧化值的测定

过氧化值（peroxide value，POV）的测定参照文献[10]。

1.3.4 酸价的测定

酸价（acid value，AV）的测定参照文献[11]。

1.3.5 脂质的提取

脂质提取参照文献[12]的方法并稍作修改。采用真空冷冻干燥技术对鱼肉样品进行冻干处理，取10 g冻干的熟制鲣鱼暗色肉，加入200 mL氯仿-甲醇溶液（体积比为2∶1），超声1 h，4 ℃浸提24 h，滤纸过滤后，滤液与50 mL 0.9%（质量分数）氯化钠溶液充分混合，静置分层后取氯仿层（下层），经无水硫酸钠干燥后在45 ℃下旋转蒸发，氯仿完全蒸发后得到脂质样品，用于后续指标的测定。

1.3.6 甘油三酯质量分数的测定

参照文献[13]的方法采用试剂盒测定1.3.5节所提取脂质样品中TAG的质量分数。

1.3.7 磷脂质量分数的测定

参照文献[14]中的钼蓝比色法测定1.3.5节脂质样品中磷脂（phospholipid，PL）的质量分数。

1.3.8 游离脂肪酸质量分数的测定

参照文献[15]的方法并稍作修改，采用铜皂比色法测定1.3.5节脂质样品中游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）的质量分数。将脂质样品用氯仿溶解并定容至50 mL，在45 ℃下旋转蒸发，氯仿完全蒸发后加入3 mL正庚烷溶解，振荡1 min后加入1 mL铜试剂（5%（质量分数）乙酸铜溶液，用吡啶调至pH 6.1），振荡2 min，静置10 min后于715 nm波长处测定样品吸光度，以油酸为对照样品绘制标准曲线，根据标准曲线计算FFA的质量分数。

1.3.9 脂质分级与脂肪酸成分分析

参照文献[16]进行脂质分级并稍作修改，利用氨基固相萃取小柱将1.3.5节脂质样品分为TAG、PL和FFA组。先用5 mL氯仿活化小柱，然后取1.3.5节脂质样品溶于1 mL氯仿后上样，分别用9 mL氯仿-异丙醇（体积比2∶1）、7 mL 25%（质量分数）乙酸-乙醚和16 mL甲醇依次洗脱TAG、PL和FFA。分别收集对应的洗脱液并用氮气吹干，于-20 ℃冻存，备用。

参照文献[17]的方法进行测定并稍作修改。将1.3.5节脂质样品及其洗脱后的脂质组分（TAG、FFA和PL）制备为脂肪酸甲酯，然后进行脂肪酸成分分析。样品制备方法如下：取10～60 mg样品，加入2 mL 0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液，60 ℃皂化30 min，冷却至室温（约25 ℃）后，再加入2 mL 25%（质量分数）的BF-甲醇溶液，60 ℃酯化20 min，再次冷却至室温后，加入2 mL正己烷，振摇2 min使溶液充分混匀，然后加入2 mL饱和NaCl溶液以除去混合溶液中的水。静置分层后取1 mL有机相（上层）用于脂肪酸分析。

气相色谱条件：DB-23毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），氦气流速1 mL/min，分流进样，分流比30∶1，进样体积1 μL；进样口与接口温度均为270 ℃；升温程序：初始温度60 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升至160 ℃，再以8 ℃/min升至210 ℃，最后以3.15 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。

质谱条件：电子电离电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，接口温度270 ℃，扫描范围35～500/。

定性定量分析：实验数据与NIST 11谱库数据库相匹配，概率得分低于50（最大值100）的组分视为未鉴定出，不同脂质成分中脂肪酸的含量采用内标法计算，结果表示为mg/g（以冻干鱼肉质量计）。

1.4 数据处理与分析

实验设置3个平行，结果以平均值±标准差表示。采用Excel软件进行数据处理，采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan检验进行显著性分析。采用MetaboAnalyst 5.0数据库（https://www.metaboanalyst.ca/）进行PCA、PLS-DA和相关性分析。采用Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 冻融循环对熟制鲣鱼暗色肉pH值的影响

pH值是评价所建立模拟模型合理性的一个重要指标。熟制鲣鱼暗色肉在冻融过程中的pH值的变化如图1所示。鱼肉在未经过冻融时呈弱酸性，可能的原因为鲣鱼体内积累了乳酸，使得鱼肉肉质偏酸。随着冻融次数的增加，鲣鱼暗色肉的pH值呈现逐渐下降的趋势，冻融8 次后pH值从6.83（冻融0 次）下降至6.44。这可能是因为在反复冻融的过程中，冰晶体对鱼肉肌肉组织造成不可逆的机械性损伤，导致鱼肉的持水能力下降并且蛋白质发生变性，氢离子释放，致使pH值降低。

图1 冻融循环对熟制鲣鱼暗色肉pH值的影响Fig. 1 Effect of F-T cycle on pH of dark meat of cooked bonito

2.2 冻融循环过程中熟制鲣鱼暗色肉过氧化值和酸价的变化

POV是评价脂质氧化初级阶段过氧化产物生成的重要指标。由图2可知，在未经过冻融时（冻融0 次），熟制鲣鱼暗色肉的POV为0.49 g/100 g，随冻融次数的增加POV逐渐增加，冻融8 次的样品POV达到1.61 g/100 g，这一现象说明低温虽然能够延长水产品的货架期，但是脂质氧化现象仍然存在。更重要的是，暗色肉含有丰富的血红素铁，冻融循环过程中由于温度波动，形成的不规则冰晶体会对鱼肉组织细胞造成损伤，导致血红素铁等促氧化物质释放，加速了冷冻和解冻过程中脂质的氧化，过氧化物逐渐累积。此外，在冻融后冰晶升华，肌肉中出现海绵状孔隙结构，脂质与空气接触面增大也会加剧脂质氧化。Pan Na等发现随着冻融次数的增加，速冻肉饼中脂质氧化程度加剧。此外，鲣鱼暗色肉富含多不饱和脂肪酸，有研究表明多不饱和脂肪酸相较于单不饱和脂肪酸更容易发生氧化。

图2 冻融循环对熟制鲣鱼暗色肉POV和AV的影响Fig. 2 Effects of F-T cycles on POV and AV of dark meat of cooked bonito

冻融循环对鲣鱼暗色肉AV的影响如图2所示，在未经过冻融时，鱼肉的AV为11.20 mg/g，随着冻融次数的增加，AV逐渐增加。与冻融0 次鱼肉相比，冻融8 次后，熟制鲣鱼暗色肉的AV（18.94 mg/g）增加了7.74 mg/g。这可能是因为熟制鲣鱼暗色肉中的脂质在冻融循环过程中氧化产生的初级产物进一步分解成小分子醛、酮、酸等化合物，随着冻融次数的增加，这些小分子化合物不断积累，从而使AV在冻融循环过程中呈总体上升的趋势。此外，温度波动有利于某些微生物（如嗜冷菌等）的生长，嗜冷菌等微生物产生的脂氧化酶会加剧脂质氧化酸败，导致AV升高。冻融循环过程中AV的变化与pH值分析结果相印证，即随着冻融次数的增加，暗色肉的酸性显著降低（＜0.05）。Yu Manman等研究发现新鲜海螺在冷藏10 d后，AV由32.48 mg/g升高至71.78 mg/g，与本研究结果相似。

2.3 冻融循环过程中熟制鲣鱼暗色肉脂质组成的变化

熟制鲣鱼暗色肉在冻融过程中脂质组成变化如表1所示，冻融0 次鱼肉所提取的脂质样品中，TAG的质量分数（74.12%）最高，FFA的质量分数为11.14%，PL的质量分数为6.51%。说明TAG是最主要的脂质成分，其次是FFA和PL。冻融循环对鱼肉的脂质组成有明显的影响，TAG的质量分数随着冻融次数的增加不断减少，从74.12%（冻融0 次）减少至67.50%（冻融8 次），PL的质量分数也逐渐下降，但FFA的质量分数从冻融0 次的11.14%增加到冻融8 次的17.57%。可能的原因为冻融过程中一些生化反应仍在进行，温度波动有利于某些嗜冷微生物的生长繁殖，这些微生物会产生脂肪酶，催化TAG和PL发生水解，TAG水解生成甘油二酯和甘油一酯，PL水解成甘油、磷酸和脂肪酸，导致FFA的质量分数升高。此外，Yu Manman等研究表明PL的水解与海螺中磷脂酶的活性密切相关，并发现脂质水解导致FFA的含量增加，PL和TAG的含量降低。

表1 熟制鲣鱼暗色肉在冻融循环过程中脂质组成的变化Table 1 Changes in lipid composition in dark meat of cooked bonito during F-T cycles

2.4 冻融循环过程中熟制鲣鱼暗色肉脂质中脂肪酸组成的变化

熟制鲣鱼暗色肉在经过冻融循环后脂肪酸的组成变化如表2所示。熟制鲣鱼暗色肉共鉴定出18种脂肪酸，其中总单不饱和脂肪酸的含量最高，总饱和脂肪酸和总多不饱和脂肪酸次之。饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸中含量最高的脂肪酸分别是棕榈酸（C）、油酸（C）和EPA。白冬的研究发现鲣鱼鱼肉中C和硬脂酸的含量均较高且鲣鱼各个部位的DHA和EPA等多不饱和脂肪酸含量丰富，本研究结果与其一致。冻融0 次与冻融8 次样品的总单不饱和脂肪酸含量没有发生显著变化（＞0.05）。但随着冻融次数的增加，总饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸均略有下降，总饱和脂肪酸含量由冻融0 次的108.21 mg/g降低到冻融8 次的98.12 mg/g，总多不饱和脂肪酸含量由冻融0 次的71.21 mg/g下降到冻融8 次的61.08 mg/g。其中EPA和DHA的含量随着冻融次数的增加也不断减少，分别在冻融8 次时降至18.22 mg/g和16.48 mg/g，可能的原因为鲣鱼暗色肉脂肪酸含量丰富，在冻融过程中极易发生氧化且相较于饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，多不饱和脂肪酸更容易发生自氧化，这可能与其自身具有较多的不饱和双键有关，且冻融循环在某种程度上降低了鱼肉的营养价值。此外，随着冻融次数的增加，不同大小和分布的冰晶体对肌肉组织有不同程度的破坏作用，导致一些促氧化因子释放，加速脂肪酸氧化降解成小分子化合物，进而导致脂肪酸含量降低。此外，多不饱和脂肪酸氧化分解会产生小分子化合物（如酸类物质），导致AV升高，与本研究AV的变化趋势相互印证。彭珠妮研究发现水煮牛肉在冷藏期间单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸含量相对稳定，多不饱和脂肪酸更易氧化。Zhou Xin等在研究贻贝肉时有同样的发现，随着冷藏时间的延长，贻贝肉中多不饱和脂肪酸的含量减少。

表2 冻融循环过程中脂质中脂肪酸组成的变化Table 2 Changes in fatty acid composition of total lipids during F-T cycles

2.5 冻融循环过程中3种脂质成分中脂肪酸组成的变化

为了进一步探究熟制鲣鱼暗色肉在冻融循环过程中脂质的变化，本实验分别分析了TAG、PL和FFA中的脂肪酸组成。冻融循环过程中暗色肉TAG和PL中脂肪酸组成的变化情况如表3、4所示。随着冻融次数的增加，TAG和PL中脂肪酸总量均减少，其中TAG中C含量从冻融0 次的44.16 mg/g下降到冻融8 次的40.61 mg/g；C含量从冻融0 次到冻融8 次下降了10.02 mg/g。此外，PL中总饱和脂肪酸和总多不饱和脂肪酸含量显著下降（＜0.05），特别是总多不饱和脂肪酸含量从冻融0 次时的12.90 mg/g降至冻融8 次的7.73 mg/g，其中，在总饱和脂肪酸和总多不饱和脂肪酸中含量最高的C和DHA分别在冻融8 次后含量分别下降了1.53 mg/g和4.18 mg/g。可能的原因为冻融过程中多不饱和脂肪酸极易氧化，且温度的波动有利于部分微生物的生长繁殖，其产生的脂肪酶会催化脂质氧化水解，随着冻融次数的增加，TAG和PL中脂肪酸的含量逐渐减少，FFA被释放出来。这一结果与2.3节脂质的组成变化结果相印证。

FFA是脂肪氧化的主要底物，在肉制品风味形成中发挥着重要的作用。由表5中可知，随着冻融次数的增加，FFA中的总多不饱和脂肪酸从冻融0 次的17.76 mg/g增加到冻融8 次的37.72 mg/g，总单不饱和脂肪酸由10.22 mg/g增长到15.22 mg/g。相较于冻融0 次样品，暗色肉冻融8 次后C的含量增加了2.54 mg/g，EPA和DHA的含量也分别增加了6.87 mg/g和11.18 mg/g。Zhou Xin等也发现贻贝在冷藏期间FFA的含量增加，TAG和PL的含量减少。此外，冻融8 次与冻融6 次相比较，总饱和脂肪酸和总单不饱和脂肪酸的含量降低，主要原因可能是FFA被氧化成小分子风味化合物。

表3 冻融循环过程中TAG中脂肪酸组成的变化Table 3 Changes in fatty acid composition of TAG during F-T cycles

表4 冻融循环过程中PL中脂肪酸组成的变化Table 4 Changes in fatty acid composition PL during F-T cycles

表5 冻融循环过程中FFA中脂肪酸组成的变化Table 5 Changes in fatty acid composition of FFA during F-T cycles

2.6 冻融循环过程中脂质组分质量分数与脂质氧化指标之间的关系

采用PCA、PLS-DA和相关性分析对熟制鲣鱼暗色肉在冻融循环过程中POV、AV、pH值以及脂质组分中TAG、PL和FFA的质量分数之间的相互关系进行了评价。如图3A所示，PC1和PC2方差贡献率分别为88.1%和6.4%，累计方差贡献率大于85%，说明PC1和PC2能较好地反映总体的特征，且不同冻融次数的鱼肉分布的位置距离较远易于区分，表明经过不同冻融次数的鱼肉之间存在一定差异性。冻融8 次熟制鲣鱼暗色肉与AV、POV和FFA质量分数的距离较近，说明其存在一定的相关性，可能的原因是暗色肉在冻融8 次后脂质氧化程度较严重。变量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）是用来衡量冻融循环对脂质氧化影响程度的指标。VIP＞1说明影响力较大，由图3B可知，VIP＞1的指标主要包括AV、TAG、FFA和POV，表明这几个指标可以区分冻融8 次的样品与未冻融的样品。POV、AV、pH值、TAG质量分数、PL质量分数和FFA质量分数之间的相关性分析结果如图3C所示，FFA质量分数与POV、AV呈正相关，与PL质量分数、TAG质量分数、pH值呈负相关。

图3 冻融循环对熟制鲣鱼暗色肉中3种脂质质量分数与脂质氧化指标之间的相关性分析结果Fig. 3 Correlation analysis of contents of three lipid components and lipid oxidation indices in dark meat of cooked bonito during F-T cycles

3 结 论

熟制鲣鱼暗色肉在冻融循环过程中，随着冻融次数的增加，鱼肉的POV和AV逐渐升高，pH值和总多不饱和脂肪酸含量逐渐降低，表明在冻融循环过程中脂质发生氧化分解且随着冻融次数的增多氧化程度加剧。此外，脂质不同组分的含量有显著的变化，随着冻融次数的增加，TAG和PL的质量分数明显降低，FFA的质量分数明显升高。TAG和PL中总饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的含量随着冻融次数的增加不断降低，FFA中总多不饱和脂肪酸的含量逐渐升高，说明冻融过程中TAG和PL水解，释放出FFA。最后通过PCA、PLS-DA和相关性分析对熟制鲣鱼暗色肉在冻融循环过程中POV、AV、pH值、TAG质量分数、PL质量分数和FFA质量分数之间的相互关系进行评价，结果表明经过不同冻融次数的鱼肉之间存在差异性，且熟制鲣鱼暗色肉在冻融8 次后脂质氧化程度较严重。此外，FFA与POV、AV呈正相关，与PL、TAG、pH值呈负相关，说明冻融循环会影响熟制鲣鱼暗色肉脂质组成，同时引起脂质发生氧化分解。本实验为探究水产品及其半成品在长途贮运过程中脂质的变化提供参考，且对水产品及其半成品在长途贮运过程中延缓脂质氧化分解措施的选择也具有一定的帮助。