88份糯玉米自交系纹枯病抗性鉴定与评价

章慧敏， 宋旭东， 周广飞， 张振良， 冒宇翔， 陈国清，2， 陆虎华， 石明亮， 黄小兰， 薛 林，2， 郝德荣

(1.江苏沿江地区农业科学研究所，江苏南通 226012； 2.江苏省现代作物生产协同创新中心，江苏南京 210095)

纹枯病是世界范围内最严重、最广泛的作物病害之一。近年来，玉米种植密度和氮肥用量的增加，导致田间气候环境条件更加有利于纹枯病的频繁发生，纹枯病呈逐年加重趋势，已成为制约玉米产量持续增长的主要病害之一。该病害每年发病率约为40%，严重时可达70%(某些地区或品种可达100%)。由玉米纹枯病引起的产量损失为10%～20%，严重时可达35%。随着全球气候变暖，玉米纹枯病造成的损失趋于恶化，选育和推广抗纹枯病品种迫在眉睫。

国内外研究表明，迄今为止尚未发现对玉米纹枯病免疫的自交系，中高抗种质材料较少，主要为R15、R09、CML163、CML270、CML429、PA31等自交系和糯玉米农家种。其中，大部分被鉴定的糯玉米农家种对纹枯病表现出较好的抗性。本研究收集88份糯玉米自交系，为探明这些材料对纹枯病的抗性，采用人工接种的方法，对该群体进行抗性鉴定与评价，筛选出抗性较好的自交系。同时利用芯片技术对抗性材料进行基因分型和遗传结构分析，划分其杂种优势群，以期为抗纹枯病玉米育种提供重要信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料与田间试验

试验材料是江苏沿江地区农业科学研究所(江苏省玉米种质资源基因库)保存、收集和创制的 88份糯玉米自交系。试验所用菌种是从江苏省玉米纹枯病典型病株上采集得到的菌核分离纯化后获得。

所有供试材料采用随机区组排列，单行区种植，2次重复，单行区面积为3.0 m×0.7 m，每份材料种植1行(定植 12 株)，设感病对照掖478和中抗对照昌7-2。于2020年、2021年6月进行重复鉴定。试验地设在江苏省沿江地区农业科学研究所玉米病虫害鉴定圃内。

1.2 抗性鉴定与数据分析

利用江苏省典型玉米纹枯病的菌核，在室内无菌条件下进行分离纯化得到病原菌，灭菌后于培养基上进行扩大培养，随后将活化的菌株接种到灭菌木皮上，加入适量培养液，在28 ℃条件下培养3 d获得田间接种用病原菌物。于玉米拔节期将带菌火柴接入玉米植株地上第3个叶鞘内，每个材料接种8株。接种后5、10 d分别调查病斑长度，并在接种 25 d 后进行田间病级调查，计算病情指数，根据病情指数评价其抗性类型(表1)。数据分析采用R 4.0.5(https：//www.r-project.org/)完成。

表1 玉米纹枯病病情指数及抗性评价标准

病情指数=∑(病级×该病级株数)/(调查总株数×最高病级)×100。

1.3 基因分型与数据处理

委托中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司采用Axiom® Maize56K SNP芯片对供试自交系进行基因型分析。根据Affymetrix(Thermo Fisher)的筛选标准，获得32 854 个高质量单核苷酸多态性(SNP)标记用于群体结构分析。利用PowerMarker 3.25 软件估算Nei’s遗传距离，选择邻接(Neighbour-Joining，简称NJ)法进行聚类分析，结合MEGA 7绘制亲缘关系树状图，划分杂种优势群。

2 结果与分析

对88份糯玉米自交系2年的病情指数(DI)、接种后5 d病斑长度(5DAI)和接种后10 d病斑长度(10DAI)进行调查分析，发现供试自交系抗感表型变异丰富。2020年与2021年的病情指数平均值分别为88.83、84.82，变异范围分别为40.74～100、37.04～100；接种后5 d的病斑长度平均值为15.57、13.77cm，变异范围为7.67～28.00 cm和4.60～24.83 cm；接种后10 d的病斑长度平均值为33.41、41.23 cm，变异范围为21.33～53.00 cm和22.50～54.33 cm。接种后5 d的病斑长度变异系数相比于其他2个表型的变异较高，其2年的变异系数分别为25.89%、26.01%(表2)。

表2 88份自交系抗性表型鉴定描述性分析

2.1 88份糯玉米自交系对纹枯病的抗性

经过2年纹枯病病菌人工接种鉴定发现，供试自交系中没有对纹枯病免疫或高抗的种质，仅发现9份抗(R)和中抗(MR)纹枯病的糯玉米种质材料，占全部种质资源的10.23%，其中以W.58抗性最好，该自交系2年度的平均病情指数分别为40.74、37.04，是所鉴定自交系中唯一的抗性材料(表3)。以W.144等为代表的8份中抗材料占总数的9.10%，病情指数在46.67～59.26之间。感病(S)及高感(HS)自交系79份，占比为89.77%。以上结果表明，筛选鉴定得到的抗性材料较少。

表3 88份糯玉米自交系病情指数与抗性评价

挑选出接种后5、10 d病斑长度在前25%的自交系，将其与抗及中抗自交系进行集合分析(图1)，发现在所有集合中均包含的仅有1个自交系，为W.144；20-5DAI、20-10DAI、21-5DAI|DI中共有自交系有2个，分别为W.55、W.58；20-5DAI、21-5DAI、DI中和21-10DAI、DI中共有自交系均只有1个，分别为W.142、W.106；而W.43、W.54、W.183、W.190未在其他任何一个病斑长度的集合中出现。这表明，抗性种质的抗性表现在各个阶段可能有所差异，有些种质如W.144在各个时期均表现为较好的抗性，而其他则可能在前期表现抗性或后期才表现出抗性。

2.2 9份抗及中抗糯玉米自交系的杂种优势群划分

以衡白522(W.131)和通系5(W.191)为对照自交系，采用玉米Maize56K SNP芯片对9份抗及中抗自交系进行基因型分析。利用 PowerMarker 3.25估算 Nei’s 遗传距离，选择NJ法对9份抗及中抗自交系进行聚类分析。结果(图2)表明，W.55、W.54、W.183和W.190属于通系5类群 ，W.58、W.106属于衡白522类群，W.43、W.142和W.144属于其他另外2个类群。其中，W.190与通系5亲缘关系最近，W.58与衡白522亲缘关系最近。

2.3 病情指数与部分农艺性状及病斑长度相关性分析

对88份糯玉米自交系的 3种农艺性状、接种后5、10 d的病斑长度与病情指数进行相关性分析。结果(图3)表明，玉米纹枯病的病情指数与株高(PH)、穗位高(EH)、穗下节数(1)呈极显著负相关(<001或<0001)，与穗下节间长度(2)为负相关，与接种后5 d的病斑长度、接种后10 d的病斑长度无相关性。这表明，植株的抗性受株高、穗位高、穗下节数影响较大，植株越高、穗位越高、穗下节间数越多、穗下平均节间距越大，其病情指数越低，抗性越好。相关性分析结果也表明，接种后5 d的病斑长度仅与接种后10 d的病斑长度呈极显著正相关(<0.001)，而与其他性状均无显著相关性， 说明接种后5 d的病斑长度表型受其他性状的影响较小。

3 讨论

玉米纹枯病是由立枯丝核菌引起的真菌性病害，在我国各玉米主产区普遍发生，是南方玉米区的重要病害之一。目前，筛选抗病种质仍是玉米抗纹枯病育种最为根本且有效的方法。李芦江等经大量鉴定筛选，在普通玉米中挖掘了一些抗性较为稳定的种质材料，但数量较少。程伟东等对糯玉米农家种进行纹枯病病菌接种鉴定，发现糯玉米农家种中有较多抗性较好的种质。本研究筛选得到的糯玉米抗病种质较少，原因可能在于2020—2021年江苏省雨水偏多，温湿度条件十分适宜纹枯病病害发生，致使抗病对照C7-2也表现出高感纹枯病。值得关注的是，在此种高压筛选条件下，群体中仍筛选出9份抗和中抗种质，说明这些种质抗性较为稳定，值得后续进行深入研究与应用。而抗性种质的抗性表型在各个阶段有所差异，原因可能在于不同材料自身对病害的抗性持久性或强度不同。又或在与病原菌博弈中，不同自交系在不同阶段可能采取的防御策略不同，导致表现出的抗性表型或其他表型在各个阶段不一样。

利用分子标记对种质资源进行遗传多样性分析的目的和意义在于能使研究人员比较准确地了解材料所属的杂种优势群，以免育种家大量盲目测配，提高自交系利用效率。高嵩等利用SNP标记对205份普通玉米种质进行类群划分，优化杂交组配，选育出吉单 563。赵久然等通过Maize SNP3072 芯片，将 344 份自交系划分为 8 个类群，明确了京科 968 系列品种的杂优模式“群×黄改群”的形成。本研究基于SNP标记将9份抗性材料归类于4个类群中， 为后续抗病种质资源的利用和品种选育工作提供了重要信息，将大大提高抗病育种工作效率。

玉米纹枯病抗性鉴定工作繁琐，费时费工，利用其他关联表型(如株高、穗位高等)作为鉴定标准可能会缩短抗病种质筛选时间。李芦江等发现，玉米的株高和穗位高与植株病情指数呈极显著相关，本研究的结果与以上结果相似。然而，玉米株高和穗位过高，并不利于其他性状的遗传改良工作，且株高或穗位高的种质所表现出的抗病性状是否与其带有抗病基因有关还需进一步深入研究。株高或穗位较高的种质材料表现出抗病可能是由于病原菌侵染速度一样，但到达穗位的距离不同所引起的，并非携带抗病基因。因此，株高、穗位高等性状可以适当考虑，而不宜作为抗纹枯病育种重点关注的表型。通过研究发现，病情指数受农艺性状影响较大，并不适合于做需要精确表型的基因定位。相反接种后5 d病斑长度与其他性状相关性较小，受其他因素影响小，能在同一水平下更好地做到表型准确，获得的定位信息也许更准确。