回收甲状腺细针穿刺液基细胞进行BRAFV600E检测的应用价值

曹 丹，吕京澴，陈汝蕾

（南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院病理科，江苏 苏州 215002）

随着甲状腺结节发病率的提高，除了超声检查外，多项研究表明，细针穿刺细胞学（fineneedle aspiration cytology, FNAC）联合BRAFV600E检测可以提高术前甲状腺良恶性结节的诊断率[1-2]，并且BRAFV600E突变状态对甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma, PTC）的治疗及预后的评估具有重要的指导意义[3]，它的特异性高达95.5%～100.0%[4-5]，但是敏感性较低，仅有40%～56%[6-7]，且存在一定比例的假阴性率，主要是由于细针穿刺的局限性，用于检测的肿瘤细胞含量不足引起。根据FNA指南，由于不同的检查需要，通常每个结节会穿刺2～3 次，细胞学样本置于细胞保存液中，基因检测样本保存于细胞裂解液中。而实际操作中，每一次穿刺得到的细胞量并不是平均的，分别用于细胞学和基因检测的样本量也会不同，有时会出现液基涂片肿瘤细胞丰富，但用于基因检测的细胞量不足，或者细胞总量虽然够，但肿瘤细胞比例少，含大量的非肿瘤细胞，如正常滤泡上皮细胞和淋巴细胞等，因此出现细胞学诊断明确为PTC，而BRAFV600E结果模棱两可的现象。本文对工作中遇到的这类液基涂片细胞进行回收，再次扩增阻滞突变系统PCR（amplification refractory mutation system PCR, ARMS-PCR），分析BRAFV600E突变情况，并将术后病例的组织学类型归纳总结。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集我科2021年1月—8月的样本库中经两名医生按照甲状腺Bethesda标准诊断为PTC的液基涂片18 例，每张片子上至少有6簇及以上的细胞团，同时18 例标本的BRAFV600E的扩增曲线高于基线，但没有呈完整的S型，按照诊断标准阳性诊断依据不足。

1.2 主要试剂仪器 二甲苯、无水乙醇购于国药集团， DNA提取试剂盒、人类BRAFV600E突变检测试剂盒购于厦门艾德医药科技有限公司，水浴锅购于上海精宏实验设备有限公司，离心机和紫外分光光度计购于赛默飞世尔科技有限公司，PCR仪购自罗氏公司。

1.3 液基涂片细胞再回收 将所选液基片子通过数字扫描技术形成数字切片并储存，把其置于烤片机上5 min，直至树胶变软融化，揭掉盖玻片迅速置于二甲苯中10 min，再将其转移至无水乙醇中10 min后取出，将组织吹干，在1.5 mL离心管中加入180 μL细胞裂解液，用移液器吸取30 μL滴加到涂片的细胞区域，在湿润状态下用一次性手术刀片将组织刮下，并用少量裂解液将剩下的细胞冲洗于离心管中，随后按照核酸提取试剂说明书进行DNA提取。

1.4 检测DNA的浓度与纯度 紫外分光光度计测量260 nm（A260）和280 nm（A280）的吸光度值，得到DNA浓度和纯度，当A260/A280为(1.8±0.1)时，说明提取的总DNA纯度合格，随后对样本进行定量，浓度大于5 ng/μL者，稀释至1 ng/μL，浓度低于5 ng/μL者，原液上机。

1.5 ARMS法检测BRAFV600E的突变情况 按照说明书配制反应混合液，设立阴性对照（negative control,NC）和阳性对照（positive control, PC），使用ARMS法对所提取DNA的BRAFV600E突变状态进行检测，反应结束后将阈值线调节至扩增曲线升起的拐点处，得到突变FAM信号和内控VIC信号的循环阈值（cycle threshold, Ct）。首先分析NC和PC结果是否符合实验要求，再对待测样品内控进行评估，确定实验结果成功可信，最后研究样本的FAM信号，若突变检测管的扩增曲线呈S型且Ct值＜30，则为突变阳性，BRAFV600E为突变型。若样品的FAM曲线不呈S型或Ct值≥30，则为阴性，称为BRAFV600E野生型。

1.6 HE染色 对术后标本进行常规HE染色，显微镜下观察组织学类型。

1.7 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件对数据进行处理，数据以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D N A的浓度和纯度 对照组的浓度为(10.737±8.158)ng/μL，实验组的DNA浓度为(7.471±4.058)ng/μL，两者差异没有统计学意义（P＞0.05）。此外，两者纯度分别为(1.815±0.076)和(1.848±0.064)，均为合格，差异没有统计学意义（P＞0.05）。

2.2 BRAFV600E突变状态 图1为对照组，选取了1 例典型样本的扩增曲线图，图2为实验组，包含全部18 例样本的扩增曲线。两组NC均为阴性曲线，说明实验过程没有受到污染，PC的曲线正常升起，表明试剂有效。再对两组的待测样本的内控信号（VIC信号）进行分析，结果见表1，对照组Ct值为(14.267±1.040)，实验组Ct值为(13.807±0.819)，两者差异没有统计学意义（P＞0.05），均在实验要求的13～21之间，说明两组加入的总DNA量符合实验要求，实验成功。最后对两组的突变反应管进行分析，对照组样本扩增曲线高于基线，但升起时间较晚，不呈完整的S型，不符合阳性诊断标准，但也不能轻易判读为阴性。实验组结果显示：18 例样本均有平滑的上升S型曲线，与基线的交叉点在30 个循环以下，Ct值为(18.194±1.980)，具体见表1（FAM信号），我们将其判读为阳性，即为BRAFV600E突变型。

表1 各组反应管在FAM和VIC信号下的Ct值

图1 对照组FAM信号下的BRAFV600E扩增曲线

图2 实验组FAM信号下的BRAFV600E扩增曲线

2.3 组织学结果 以术后组织病理诊断结果作为金标准，18 例均确诊为PTC，见图3、图4。

图3 肿瘤呈乳头状结构，可见纤维血管轴心及砂粒体（HE×100）

图4 细胞核呈毛玻璃样，部分细胞可见核沟（HE×100）

3 讨论

甲状腺肿瘤近年来的发病率显著提高，其中PTC是甲状腺癌最常见的病理类型，占85%～95%[8]，但其预后较好，所以早诊断早治疗也显得尤为重要。FNAC是术前鉴别甲状腺结节良恶性的重要方法，具有创伤小、准确性高等优点，但其中仍有10%～40%的结节无法明确性质[9]，2015年美国甲状腺协会（ATA）指南推荐使用分子标志物来进一步诊断[10]，其中BRAFV600E是PTC的特异性分子标记物。BRAFV600E突变激活RAS-RAF-MEKERK信号通路引起细胞的恶性增殖，最终导致肿瘤的发生[11]。已有多项研究[12-13]表明BRAFV600E基因突变与肿瘤大小、被膜外侵犯及颈部淋巴结转移密切相关，提示其突变是PTC复发的独立危险因素。本文用ARMS法检测BRAFV600E的突变状态，DNA分别提取自细胞裂解液（对照组）和已经制片的液基涂片（实验组），结果显示实验组浓度低于对照组，可能由于实验组的细胞来自于再提取，从液基细胞制片过程到再提取操作，都会损失部分细胞，而对照组是直接从细胞裂解液中提取，几乎没有损失，但两组差异没有统计学意义（P＞0.05），并且两组内控均合格，说明实验组虽然浓度低，但加入PCR反应体系的DNA总量是够的。PCR结果显示实验组中18 例均为BRAFV600E阳性，我们认为与对照组相比，实验组的阳性率显著提高的原因是由于提取的是总DNA，虽然对照组浓度更高，但可能其中正常细胞较多，肿瘤细胞比例少，低于ARMS法能检测出的最低1%突变的标准，造成BRAFV600E结果的不明确，而实验组再提取直观地选取了有丰富肿瘤细胞数量的标本，相当于事先对肿瘤细胞量进行了评估，所以阳性率大大提高，最后组织学结果也证实了我们的术前诊断。

虽然从液基涂片中再提取DNA进行BRAFV600E检测的应用价值得到了证实，但是此项操作还有一些方面需要我们进一步讨论。

液基涂片上的肿瘤细胞数量是决定实验成败的关键，因为操作过程不可避免地会损失部分细胞，所以需要选取有丰富滤泡细胞团的涂片，如果原本涂片上肿瘤细胞也很少，本文所述方法的应用就会受到限制。

涂片回收过程中多次使用到乙醇，乙醇作为固定剂能够快速穿透细胞，凝固核蛋白，并且不改变DNA的一级结构，可用于分子生物学技术[14]，为我们回收DNA提供了理论基础。在脱蜡过程中，用乙醇置换二甲苯，这时候乙醇要挥发干净，因为它的残留不仅会影响蛋白酶K的活性，降低DNA提取效率，还会使维持DNA双螺旋稳定性的氢键断裂，破坏碱基间的堆积力，引起DNA变性，产生一定量的单链DNA，使得A260处的吸光度增加，这也许是实验组的A260/A280比对照组稍大的原因。但是乙醇挥发时间长，又容易使得DNA暴露在空气中过久，引起为数不多的DNA降解，所以这个组织吹干时间的长短是我们需要把握好的。

据报道[15]，染色剂与DNA结合，会抑制Taq酶的活性，表现为样本内控Ct值升高，也有报道[16]认为DNA提取用的硅胶模吸附柱有滤过纯化作用，可以最大限度地除去染色剂分子，本文结果显示巴氏染色后的实验组内控均在要求的范围内，但我们未与未染色组进行比较，后续会进步一研究证实。

我们一般从浓度、纯度和完整性三个方面对DNA质量进行评估，细胞经过液基制片以及再提取过程，是否会引起DNA的片段化，本文基于研究侧重点，主要关注BRAFV600E突变状态的变化，后续也会对DNA的完整性进一步探讨。

本实验需要先得到细胞学结果，再进行BRAFV600E的检测，延长了发报告的时间，同时这也限制了此方法的常规应用。

从液基涂片中重新提取D N A再次进行BRAFV600E检测在实际应用有一定的局限性，那是否还有其他来源的标本可以替代呢？根据文献报道[17]，BRAFV600E检测标本还可以来自于液基保存液中的剩余标本，它有一定的优势，比如细胞学与分子病理报告使用同一份标本，结果更加客观，对病人来说可以少穿刺一针，降低穿刺过程的痛苦和风险。但是在细胞量少时，由于大部分样本已用于液基制片，剩余样本中的组织量会很少，并且当涂片制作不满意，需要再次制片时，会面临无标本可用的情况，因此我们不将其作为常规基因检测标本使用。在遇到本文所述的情况需要重新检测时，仍然不考虑用其作为标本来源，其一是因为相比较于直接从涂片上获取细胞，我们无法对保存液中的肿瘤细胞数量进行直观的评估，其二样本中细胞由于未经过巴氏染色，均为透明状，在进行离心的操作中，肉眼看不到细胞沉淀，会误吸导致损失大量细胞。标本还可以来源于细胞蜡块[18]，一般留存液基所需的标本量后，其余收集做成细胞蜡块，这样除了基因检测以外，还可以连续切片进行免疫组化，大大拓展了术前诊断的内容。这项技术在胸腹水、痰等标本中已经广泛应用，但是前提仍然是需要大量的细胞，而目前我们甲状腺的细针穿刺标本经过离心后，几乎得不到细胞沉淀物，还不能满足此项目的常规使用，需要穿刺医生积累经验，精准穿刺。还有报道[19]使用穿刺洗脱液进行基因检测，穿刺洗脱液用于甲状腺球蛋白含量的测定已经得到了广泛应用，但是在基因检测方面，由于其得到的肿瘤细胞量非常少，所以其实际应用价值仍待研究。

综上所述，当我们常规进行BRAFV600E检测时，遇到肿瘤细胞含量特别少，导致检测结果出现模棱两可的情况，而这份病例对应的液基涂片又细胞含量丰富，那么从中再提取DNA重新进行一次基因检测不失为提高术前诊断结果准确率的好方法。由于本文所述的情况较为特殊，我们还没有收集到更多的病例，后续会扩大样本量，优化实验条件，继续探讨。