老年克罗恩病患者血清微小RNA-215、微小RNA-335表达及与肠道菌群的相关性

王小全

（黑龙江省佳木斯市中心医院 消化内科，黑龙江 佳木斯 154002）

克罗恩病为一种自身免疫性肠道疾病，有着病程长、易复发等特点，在我国发病率约1.4/10万［1］。目前的医疗技术尚无法彻底治愈克罗恩病［2］，因此仍需对该病发病机理进行长期研究探索，以期对该病的诊治提供帮助。近年来，克罗恩病发生发展中肠道菌群结构变化逐渐引起临床工作者的重视，诸多学者认为肠道菌群失衡参与克罗恩病病情进展，可引起肠道细菌移位，促发炎症反应［3］。微小RNA（microRNA,miR）是一类与诸多生命活动关系密切的单链非编码RNA 小分子，在炎症性肠病中发挥重要作用，随着学者对miRNA 的不断鉴定和探索，发现miR-215、miR-335均与克罗恩病的发病相关［4-5］。为此，本研究探讨了老年克罗恩病患者血清miR-215、miR-335 表达及与肠道菌群的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

获佳木斯市中心医院医学伦理委员会批准（批准号XYFY2018-KL002-01），并取得患者的知情同意。选择2019 年4 月至2021 年4 月佳木斯市中心医院收治的126 例克罗恩病患者为观察组，男90 例；汉族99 例；体质量指数（22.72±3.75）kg/m2；年 龄60～85 岁，平 均（67.81±3.80）岁；病 程6～60 个 月，平 均（38.36±15.17）个月；吸烟史37 例，饮酒史51 例；病变部位：回肠57 例，结肠22 例，回结肠47 例；临床类型：狭窄型31 例，穿透型19 例，非狭窄非穿透型76 例。同期体检健康者100 例为对照组，男72 例；汉族79 例；年龄60～83 岁，平均（68.01±3.64）岁；体质量指数（22.80±3.51）kg/m2；吸烟史31 例，饮酒史42 例。两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：克罗恩病据《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2018 年·北京）》中有关诊断标准确诊［6］；无其他肠道疾病；病程6 个月以上；肝、肾等重要脏器无功能异常。排除标准：合并甲状腺功能疾病；合并凝血系统疾病；依从性差；病历资料不全；合并自身免疫性疾病；合并恶性肿瘤；合并精神性疾病；合并内分泌疾病；近期有卒中史；入院前已接受相关治疗；合并心血管疾病。

1.2 仪器与试剂

台式低速血液离心机（上海信裕生物科技有限公司，型号XY-2637）；PCR 检测仪（上海佑隆生物科技有限公司，型号DNAble@）；Baypure 通用型磁珠法总RNA 提取试剂盒（广州湾区生物科技有限公司，批号WADM-48-K）；肝素钠抗凝管（上海圻明生物科技有限公司，批号OX02832）；TaqMan miRNA 反转录试剂盒（哈尔滨新海基因检测有限公司，批号D1803）；需氧培养基（北京百奥莱博科技有限公司，批号SNM542-QZV）；厌氧培养基（上海赫澎生物科技有限公司，批号BR038）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 入院次日清晨，空腹取5 mL 外周静脉血，3 000 r/min 离心10 min，取上清液，冰箱保存待测。取新鲜粪便0.5 g，依据10 倍稀释法稀释至10-8，留取10 μL，冰箱保存待测。

1.3.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RTPCR）实验［7］采用总RNA 提取试剂盒对血清中的总RNA 予以提取，对总RNA 浓度予以测定，再经反转录获得cDNA，以此cDNA 为模板在相关仪器上进行PCR 扩增。PCR 扩增体系共10 μL，其中包含cDNA 1 μL、MiScript SYBR Green Mix 5 μL、上下游引物各0.5 μL 及双蒸水3 μL。PCR反应条件：95℃预变性90 s，95℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸15 s，总共40 个循环。扩增产物凝胶电泳，采集电泳照片，对各扩增条带吸光度值进行测定。miR-215 或miR-335 相对表达量=miR-215 或miR-335 扩增条带吸光度值/U6 扩增条带吸光度值×100%。

1.3.3 肠道菌群数量检测［8］将10 μL 粪便稀释液，大肠杆菌和肠球菌采用需氧培养基予以培养，乳酸杆菌和双歧杆菌采用厌氧培养基予以培养，温度设置在37℃条件下，连续培养48 h，计数菌落数。通过革兰染色、生化对细菌进行鉴定，然后计算每克粪便含菌群数（CFU/g），数据结果用对数形式表示。

1.4 观察指标

①比较2 组血清miR-215、miR-335 相对表达量；②比较2 组肠道菌群数量；③比较缓解期和活动期患者血清miR-215、miR-335 相对表达量；④采用Spearman 检验分析miR-215、miR-335 与克罗恩病疾病活动度的相关性；⑤采用Pearson 检验分析miR-215、miR-335 与克罗恩病患者肠道菌群的相关性。

1.5 统计学方法

本研究数据的统计分析在SPSS 22.0 软件上进行。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验；计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman 和Pearson 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-215、miR-335 相对表达量比较

血清miR-215、miR-335 在观察组中的相对表达量较对照组均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组血清miR-215、miR-335 相对表达量（）

表1 两组血清miR-215、miR-335 相对表达量（）

2.2 两组肠道菌群数量比较

观察组乳酸杆菌数量和双歧杆菌数量显著少于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组肠球菌数量和大肠杆菌数量显著多于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组肠道菌群数量比较（,lgCFU/g）

表2 两组肠道菌群数量比较（,lgCFU/g）

2.3 缓解期和活动期患者血清miR-215、miR-335相对表达量分析

根据简化克罗恩病活动指数（Crohn's disease activity index,CDAI）［9］将126 例克罗恩病患者分为缓解期组（CDAI≤4 分，43 例）与活动期组（CDAI＞4 分，83 例）。活动期患者血清miR-215 相对表达量（0.28±0.06）显著低于缓解期患者（0.99±0.40），差异有统计学意义（t=-11.572,P＜0.05），活动期患者血清miR-335 相对表达量（0.31±0.09）显著低于缓解期患者（0.93±0.46），差异有统计学意义（t=-8.752,P＜0.05）。见图1。

图1 缓解期和活动期患者血清miR-215、miR-335 相对表达量

2.4 miR-215、miR-335 与克罗恩病疾病活动度的Spearman 相关性

miR-215、miR-335 与克罗恩病疾病活动度均呈负相关（r=-0.640,P＜0.001；r=-0.702,P＜0.001）。见图2。

图2 miR-215、miR-335 与克罗恩病疾病活动度的相关性

2.5 miR-215、miR-335 与克罗恩病患者肠道菌群的Pearson 相关性

miR-215、miR-335 与克罗恩病患者乳酸杆菌数量和双歧杆菌数量均呈正相关（P＜0.05），miR-215、miR-335 与克罗恩病患者肠球菌数量和大肠杆菌数量均呈负相关（P＜0.05）。见表3。

表3 miR-215、miR-335 与克罗恩病患者肠道菌群的相关性

3 讨论

miRNA 为一种微小RNA 分子，起始于细胞核且成熟于细胞质，由约20 个碱基构成，在真核细胞中广泛存在，在人体脑脊液、血液、尿液、唾液等体液内均能表达，miRNA 可与蛋白质等物质构成复合物，抑制RNA 酶降解，因此miRNA 在体液中有着较强的稳定性及保守性［10］。该分子能与靶mRNA 互补结合，进而阻止其翻译，调控基因表达，还在细胞生物学行为（凋亡、增殖、分化等）及炎症性疾病、感染性疾病、消化系统疾病等疾病中发挥十分重要的作用［11］。miRNA 在健康人群中的表达谱基本一致，但该分子在不同疾病发病状态下的表达谱会出现异常变化，此种变化通常早于影像学和生化改变，因此miRNA 在多种疾病早期诊断中具有潜在应用价值［12-13］。miRNA 能够对机体内60%基因予以调节，miR-215、miR-335 是近年来新发现的miRNA，已有研究证实两个分子可介导某些代谢通路而影响克罗恩病的发生及发展［14-15］。miR-335 定位于人类染色体7q32.2，具有调节人干细胞增殖、分化及迁移的作用。报道显示［16］，miR-335 在溃疡性结肠炎中表达水平出现下调，在溃疡性结肠炎病情进展过程中发挥着重要作用。研究发现［17］，miR-335 表达水平与克罗恩病患者病变严重程度有关，可作为患者病变严重程度的评估指标之一。miR-215 定位于人类染色体1q41，动物模型实验结果显示［18］，miR-215 在克罗恩病小鼠模型中表达量明显减少，提示miR-215 分子可能参与了克罗恩病的发病过程，为了进一步探索miR-215 对克罗恩病的影响，该研究通过灌肠给予模型小鼠miR-215 过表达的腺病毒载体进行干预，发现miR-215 过表达能够显著降低小鼠CDAI 评分值，改善结肠组织病理损伤，减少白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）等促炎因子释放，表明miR-215 与克罗恩病存在密切联系。上述报道与本次研究结果相吻合，本研究中血清miR-215、miR-335 在观察组中的相对表达量较对照组均显著减低，提示血清miR-215、miR-335 在老年克罗恩病患者中呈低表达水平；活动期患者血清miR-215、miR-335 相对表达量显著低于缓解期患者，提示miR-215、miR-335 可能与克罗恩病疾病活动度均呈负相关，Spearman 相关性分析数据结果亦证实了这一结论。

克罗恩病为一种慢性炎症性肠道疾病，肠道微生态与肠道黏膜免疫的异常变化可引起肠道慢性炎症，而肠道慢性炎症状况下肠道微生态失衡现象亦可加重，病情如此反复，难以治愈［19］。因此，通过调节肠道菌群紊乱异常状态，使正常肠道微生态重新恢复，是治疗克罗恩病的重要手段之一。现临床已有粪便移植应用于治疗顽固性克罗恩病患者的报道，报道中相关数据显示患者获得良好疗效［20］。本研究显示，观察组乳酸杆菌数量和双歧杆菌数量显著少于对照组，观察组肠球菌数量和大肠杆菌数量显著多于对照组，提示克罗恩病患者肠道菌群存在紊乱异常状态。本次研究Pearson 检验分析显示，miR-215、miR-335 与克罗恩病患者乳酸杆菌数量和双歧杆菌数量均呈正相关，与肠球菌数量和大肠杆菌数量均呈负相关，可能是由于血清miR-215、miR-335 表达水平变化可改变肠道菌群结构，故而动态监测2 项指标水平变化情况，将有利于及时调节患者肠道菌群结构，有效地改善肠道炎症状态，加强机体肠上皮屏障作用，进而抑制克罗恩病病情进展。

综上所述，老年克罗恩病患者血清miR-215、miR-335 呈低表达水平，其水平与疾病活动度及肠道菌群具有一定相关性，这两项指标有望成为克罗恩病诊治的相关指标之一。但本次研究随访时间较短，有待延长时间进一步观察其预后。