液相色谱-串联质谱法检测猪血浆中除虫脲的方法学研究

徐玉珍，刘希望，秦 哲，李世宏，白莉霞，范丽萍，魏彦明，李剑勇，杨亚军

(1.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070；2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业农村部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州 730050)

除虫脲(diflubenzuron，DFB)，又名二氟隆，化学名为1-(4-氯苯基)-3-(2,6-二氟苯甲酰基)脲，CAS号为35367-38-5，分子式为C14H9F2N2O2Cl。DFB属于苯甲酰脲类化合物[1-3]，是昆虫生长调节剂，可抑制几丁质合成酶的活性，使昆虫幼虫在蜕皮时不能形成新表皮，导致虫体发育受阻、畸形而死亡，从而影响昆虫的整个世代[4]。DFB作为一种新型杀虫剂，具有高效、低毒、低残留等特点，能够有效控制种植业和林业作物中大部分害虫的幼虫，对动物体内外及养殖环境中寄生昆虫的幼虫亦有很好的抑制作用[5]。

目前，在国内外养殖场中常用的灭蝇药物主要有环丙氨嗪[6-10]、有机磷类和菊酯类药物[11-12]，以及苦参、鱼藤、黄荆等中药制剂[13]；其中，环丙氨嗪作为口服灭蝇蛆药，在国内仅批准用于鸡[14]，尚未批准用于其他动物。在美国、德国和巴西等国家，DFB已被批准作为口服灭蝇蛆药，用于猪、牛、羊等动物养殖场环境中病媒昆虫幼虫的防控[15-17]。

本研究采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)建立了猪血浆中DFB浓度的检测方法，以明确猪灌服DFB预混剂后，其活性成分在猪体内的吸收、分布和排泄的特点。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

采集6头体重为(40±5)kg健康商品化杂交猪的空白血浆，来自甘肃省定西市六禾生态农牧养殖场，肝素钠抗凝。DFB标准品(批号：19001，99.8%)，结构式见图1，购自中国计量科学研究院；DFB同位素内标除虫脲-13C6(DFB-13C6)(批号：31241403)，结构式见图1，购自Witega公司；甲醇(批号：203398，质谱纯)，购自Merck生命科学(上海)有限公司；甲酸铵(批号：186247A，质谱纯)、甲酸(批号：202674，质谱纯)、乙腈(批号：201643，质谱纯)均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；二甲基亚砜(DMSO)(批号：SHBH2446V，分析纯)购自Merck生命科学(上海)有限公司；甲醇(批号：20210114，分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；猪血浆(肝素钠抗凝，批号：M14GM148518)购自上海源叶生物科技有限公司。

图1 DFB(A)及DFB-13C6(B)结构式

1.2 主要仪器

液相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪(Agilent 1200-6410A)，购自Agilent Technologies公司；大容量低温离心机(Multifuge X3R)购自Thermo Scientific公司；样品快速蒸发系统(RapidVap)购自Labconco公司；分析天平(QUINTIX65-1CN60G型)购自Sartorius公司；涡旋混合器(Vortex-2Genie)购自Scientific industries公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18柱(3 mm×50 mm，1.8 μm)；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸水(含5 mmol/L甲酸铵)，梯度洗脱程序见表1；流速为0.4 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为10 μL。

表1 梯度洗脱程序

1.3.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，毛细管电压为+4 000 V；喷雾器压力为30 psi；干燥气温度350 ℃，干燥气流量(氮气)为10 L/min；电子倍增器电压增加值(ΔEMV)为+300 V，采用多反应离子检测(MRM)模式进行检测。优化后的MRM参数见表2。

表2 DFB的MRM参数

1.3.3 溶液的制备 DFB标准储备液：精密称取DFB标准品10 mg，加入1 mL DMSO，水浴超声，以使完全溶解，完全转入10 mL量瓶中，以甲醇稀释并定容至刻度，即为质量浓度为1 mg/mL的标准储备液，-20 ℃存放。将DFB标准储备液以10% DMSO甲醇溶液逐步稀释至100 000、1 000、800、400、100、20、2、1和0.5 ng/mL，作为中间标准储备液及标准工作溶液，-20 ℃保存备用。

DFB-13C6标准储备液：称取DFB-13C65 mg，以甲醇溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为0.5 mg/mL的标准储备液，-20 ℃存放。以甲醇稀释成质量浓度为1 μg/mL的内标工作溶液，-20 ℃保存备用。

1.3.4 猪血浆样品的处理 取猪血浆0.5 mL于5 mL离心管中，加入内标工作溶液10 μL，涡旋混匀，加2 mL甲醇，涡旋混匀1 min，4 ℃条件下4 500×g离心10 min，将上清夜转移至另一5 mL离心管中，45 ℃条件下减压浓缩至干，以500 μL甲醇-水(1∶1)完全溶解残渣，过0.22 μm尼龙滤膜，进行高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定。

1.4 方法学验证

1.4.1 专属性 取1.1采集的空白猪血浆，加入内标后，依1.3.4项下的方法进行处理、检测，记录目标分析物的色谱图，以考察DFB标准溶液、不同来源代表性的空白血浆、加标空白血浆样品等不同来源的基质对DFB检测的干扰。

1.4.2 最低检测限和最低定量限 移取0.5 mL空白猪血浆，加入1.3.3制备的不同浓度DFB标准工作溶液及内标工作溶液，涡旋混匀，制备成DFB加标样品，依1.3.4项下的方法进行处理、检测，记录色谱图，计算DFB定量离子的信噪比(SNR，按照峰高对峰高比)，结合准确度及精密度试验的结果，以确定方法的最低检测限(LOD)和最低定量限(LOQ)。

1.4.3 基质效应 移取0.5 mL空白猪血浆，依1.3.4项下的方法进行处理并复溶；加入内标工作液及1.3.3制备的不同浓度DFB标准工作溶液各10 μL，制备成低(2 ng/mL)、高浓度(800 ng/mL)水平的处理样品，每个浓度6个平行，依1.3.4项下的方法进行处理、检测，与相应浓度标准溶液的定量离子峰面积进行比较。考察6批不同来源的空白猪血浆，以评价方法的基质效应。

1.4.4 线性范围 以10%的DMSO甲醇溶液为溶剂，制备DFB浓度分别为最低定量限至1 000 ng/mL，内标浓度均为20 ng/mL的系列浓度混合标准工作溶液，依1.3.4项下的方法进行LC-MS/MS检测，以DFB与内标浓度的比值为横坐标，以DFB与内标定量离子的峰面积比值为纵坐标，根据试验结果，选取以1/x、1/y或1/x2等合适的加权方式，进行线性回归。

1.4.5 准确度和精密度 移取0.5 mL空白猪血浆，加入1.3.3制备的不同浓度DFB标准工作溶液10 μL，配制成DFB浓度分别为最低定量限及低(2 ng/mL)、中(100 ng/mL)、高浓度(800 ng/mL)的血浆样品，加入内标，依1.3.4项下的方法进行处理、检测。每个浓度水平6个平行，考察方法的准确度、精密度在批内及批间的变异情况。

1.4.6 稳定性

1.4.6.1 标准溶液稳定性 精密称取DFB标准品，依1.3.3项下的方法配制成浓度为1 mg/mL的标准储备溶液，并稀释成浓度为100 μg/mL的标准中间储备溶液，分装后于-20 ℃保存备用。分别于存放后的15和60 d取出，进行适当稀释后，与新配制的对应浓度的标准液进行比较，内标法考察储备溶液的稳定性。

1.4.6.2 样品稳定性 移取0.5 mL空白猪血浆，依1.3.4项下的方法，分别制备低(2 ng/mL)、高(800 ng/mL)浓度水平的猪血浆加标样品，进行如下考察：将加标样品于-20 ℃分别冻存30和60 d后，考察存放稳定性；将加标样品于—20 ℃冻存后，室温下融化，反复3次，考察冻融稳定性；将样品处理后，于进样前分别4 ℃冷藏12 h，及室温不避光放置12 h，以考察样品处理液的稳定性。

2 结 果

2.1 专属性

依前述方法，对DFB标准溶液2 ng/mL(图2)、不同来源代表性的空白血浆(图3)、加标空白血浆样品2 ng/mL(图4)进行处理并检测。如图所示，在DFB出峰的位置，未发现明显干扰，表明该方法选择性好，血浆基质对DFB和内标的检测无干扰。

A，DFB定量离子对311.1→158.1*；B，DFB-13C6定量离子对317.1→158.1*。图2～4同

图3 空白猪血浆的代表性MRM色谱图

图4 加标空白猪血浆的MRM色谱图(2 ng/mL)

2.2 LOD和LOQ

当空白猪血浆中DFB的添加浓度分别为0.5和1 ng/mL时，DFB定量离子的SNR均大于3和10(表3)，典型的检测色谱图见图5。本方法的LOD和LOQ分别可以达到0.5和1 ng/mL。

表3 空白血浆加标样品的信噪比检测结果

A，0.5 ng/mL，Rt 5.06 min，311.1→158.1*的SNR为26.7；B，1 ng/mL，Rt 5.06 min，311.1→158.1*的SNR为41.4

2.3 基质效应

基质效应的考察结果如表4所示，结果显示，方法的基质效应平均值在93.14%～107.94%之间，且基质效应的变异系数<10%，均符合检测要求。

表4 DFB在猪血浆的基质效应

2.4 线性范围

以1/x为权重，进行加权线性回归。结果表明，在1～1 000 ng/mL的浓度范围内，呈良好的线性关系，标准曲线方程为y=1.0197x+0.0076，R2=0.998，标准曲线见图6。

图6 DFB标准曲线图

2.5 准确度和精密度

当血浆中DFB的浓度分别为0.5和1 ng/mL时，定量离子的SNR满足定性和定量检测的要求。因此，以血浆中DFB浓度分别为0.5、1、2、100和800 ng/mL的样品，进行准确度和精密度考察。结果见表5。方法的批内和批间平均准确度在97.78%～115.06%之间，批内和批间精密度的变异系数均<10%，满足定量检测的要求。

表5 DFB在猪血浆中的准确度与精密度

2.6 稳定性

标准溶液的稳定性、加标样品的冻存稳定性考察结果见表6，表明储备液、加标样品冻存在-20 ℃条件下存放60 d较为稳定。加标样品冻融稳定性及处理后的稳定性试验结果见表7、8。不同处理条件下DFB在溶剂和血浆基质中的准确度和精密度在要求范围内，表明DFB在上述条件下稳定性良好，能满足测定要求。

表6 DFB不同条件下稳定性(准确度)

表7 加标样品冻融的稳定性(准确度)

表8 样品处理后放置12 h稳定性变化结果(含量变化率)

3 讨 论

在配制DFB标准溶液时常用的溶剂主要有乙腈、甲醇等，但是DFB在其中的溶解度较小，冻存条件下易于析出结晶，使用时需要进行再次超声溶解[18-20]。DFB在DMSO中极易溶解，因此本试验以10%DMSO甲醇为溶剂，可以很好的溶解DFB，—20 ℃长期存放时未见析出。

本试验考察了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水(5 mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸)、甲醇-水(5 mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸)等不同流动相，结果显示，在不同的流动相条件下，目标色谱峰形良好，主峰无拖尾现象，分离效果良好。但以甲醇作为流动相时，DFB的检测结果更为稳定；因此，以甲醇-水(5 mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸)为流动相。

研究报道显示，动植物及土壤样本中DFB检测的常用方法为高效液相色谱法(HPLC-UV)和LC-MS/MS[18,21-23]。刘艳萍等[21]用HPLC-UV方法测定荔枝中DFB的残留，结果显示，LOD为10 μg/kg，该浓度下DFB在全果肉中的平均回收率为82.70%。刘锦霞等[23]通过高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测猪肉中DFB等10种苯甲酰胺类杀虫剂的残留，外标法定量，结果显示，该方法的LOD为5 μg/kg，回收率在86.4%～99.4%范围内。然而，关于动物血液中DFB浓度检测的相关文献报道却较少。

相关研究资料显示[24]，DFB对大鼠的口服剂量为4 mg/kg时，其经尿液和胆汁的排泄量为总给药量的50%；当口服给药剂量为900 mg/kg时，则下降为4%。另有研究将双苯环经14C标记的DFB以5 mg/kg的剂量(推荐给药剂量为0.3 mg/kg)对猪口服给药，结果显示，给药量的82%以原形经粪便排出，5%经尿液排出[25]。说明在大剂量单次给药后，DFB在猪肠道的吸收很少。Tfouni等[17]在9头肉牛和20头奶牛体内开展了DFB的残留试验，折算后每头动物DFB的摄入量为30 mg/d，肉牛连续给药120 d，奶牛连续给药77 d，HPLC-UV法检测肉牛可食性组织及牛奶中DFB的残留量；该方法在肌肉、脂肪、肝脏、肾脏和牛奶中的LOD分别为14、6、16、15和0.6 μg/kg，LOQ分别为50、50、50、50和10 μg/kg,结果显示，在给药结束后的24 h内，各可食性组织和牛奶中均未检出DFB。以上结果表明，DFB在动物肠道的吸收较少，主要随粪便排出体外，血药浓度较低。

因此，在考察DFB口服给药的药代动力学特征时，血药浓度的检测方法应具有较高的灵敏度，检测限应该相对较低。故本研究采用LC-MS/MS建立了猪血浆中DFB浓度的测定方法。在LC-MS/MS的检测过程中，采用稳定同位素标记物DFB-13C6为内标，内标法定量提高了方法的灵敏度与准确性。在保证信噪比、准确度和精密度等方法学要求的前提下，本方法的LOD可以达到0.5 ng/mL，平均准确度在97.78%～115.06%之间。因此，该方法可以避免因口服给药后血浆中药物含量低，导致无法准确测定药物浓度的情况。

本研究所建立的猪血浆中DFB测定方法，其样品前处理方法操作简单，仪器灵敏度高，准确度和精密度等符合生物样品定量分析方法验证指导原则[26]的要求，适用于猪血浆中DFB浓度的检测，可用于评价DFB预混剂口服给药后在猪体内的药代动力学特征。

4 结 论

本研究通过LC-MS/MS建立的猪血浆中DFB检测方法简便，专属性强，灵敏度高(LOD 0.5 ng/mL，LOQ 1 ng/mL)，准确(准确度在97.78%～115.06%)，可靠(精密度均<10%)，样品的稳定性满足检测要求，适用于DFB预混剂在猪体内的药代动力学研究。