松子酒香气组成及关键香气物质间的协同作用

仲美桥，韩妍，黄一承，史玉，李丹，李晓磊

（长春大学农产品加工吉林省普通高等学校重点实验室，吉林 长春 130022）

白酒是世界上最古老的蒸馏酒之一，具有驱寒、活血、提神等功效，能够有效增进食欲、消除疲劳[1]。研究表明，适量饮用白酒可以起到扩张小血管、延缓胆固醇等脂质在血管壁沉积的作用，且能促进血液循环、降低心血管疾病和某些癌症的发生概率[2-3]。因白酒内钠、铜、锌的含量较少，几乎不含维生素和钙、磷、铁等，且风味单一，不能满足市场需求，因此近年来以白酒为基酒的各种特色露酒逐渐得到消费者的青睐。

松子是松科植物红松等的种子，是常见的坚果之一，含有丰富的不饱和脂肪酸[3]，研究报道显示松子有润肺、润肠、止咳等功效，还能够有效调节血脂及起到抗癌作用，具有很高的食疗价值[4-7]。我国松树品类繁多，松子资源丰富，但大都以初加工为主作为休闲食品，松子酒尚未得到深度开发。

松子酒营养价值高、具有良好的保健功能以及特有的香气、质地和极佳的口感，在国际市场备受青睐，但是关于松子酒香气物质的分析研究不足[8]。本研究采用的顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）是高效的气味分析方法，被广泛应用于食品风味检测[9-10]。本研究以3种市售的松子酒为原料，通过气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）检测其挥发性物质含量，并采用聚类层次分析和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA） 的方法对数据进行了分析处理，研究了香气活力值（odor activity value，OAV）及关键香气物质间的相互作用，为松子酒风味选择和品质控制提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

松子酒1号（南中纯松子露酒）：云南某酿酒厂；松子酒2号（红松宝露酒）：吉林某生物技术股份有限公司；松子酒3号（兰益松松子露酒）：泸西某酿造有限公司；己酸乙酯、丁酸乙酯、苯甲醛、2-辛醇（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

QP 2010 Ultra气相色谱－质谱联用仪：日本Shimadzu公司；DVB/CAR/PDMS萃取纤维（50/30 μm）、顶空萃取瓶（15 mL）：美国Supelco公司；DB-5MS UI毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美国 Agilent公司。

1.2 试验方法

1.2.1 HS-SPME-GC-MS分析

1.2.1.1 顶空固相微萃取条件

吸取0.5 mL样品，加入顶空萃取瓶中，加入1.5 mL去离子水及1 g NaCl，再加入10 μL 200 mg/L的2-辛醇溶液作为内标，50℃预平衡10 min，用已活化好的DVB/CAR/PDMS萃取纤维顶空吸附30 min，将萃取头插入GC进样口解吸5 min。

1.2.1.2 GC-MS分析

气相条件：DB-5MS UI毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；进样口温度 230℃，分流比 1∶5；载气 He，流速1.0 mL/min；升温程序：毛细管柱初温40℃，保持5 min，以5℃/min升至90℃，保持1 min，再以8℃/min升至230℃，保持3 min。

质谱条件：GC-MS接口温度250℃，离子源温度230℃；离子化方式：电子电离源；电子能量70 eV；质量扫描范围 30 m/z～550 m/z。

定性方法：通过对比软件标准谱库NIST11，保留相似度大于85%的物质。

定量方法：以2-辛醇作为内标物，通过半定量方法计算香气物质含量，重复3次。

1.2.2 OAV值计算

通过香气活度值（OAV）将每个香气物质对整体的贡献进行评估，香气活度值（OAV）是样品中香气物质的质量浓度与其嗅觉阈值的比率，OAV≥1的香气物质能够有效影响整体风味，OAV＜1的香气物质无实质贡献，起修饰作用，一般来说，OAV值越大则说明该物质对总体香气贡献越大[11-13]。

1.2.3 阈值测定

根据Czerny等[14]的方法并做修改，通过三点选配法（three-alternative-forced-choice，3-AFC）测定察觉阈值，感官小组由10名具有一定的感官分析经验的成员组成（5男5女，年龄20岁～25岁），嗅闻体系均为42%的乙醇水溶液。每个样品进行十次三点选配法测试，以2为稀释倍数，3个样品瓶中有一个含有待测物组分，两个为对照。检测己酸乙酯、苯甲醛、丁酸乙酯在嗅闻体系中的阈值以及3组混合物己酸乙酯和丁酸乙酯、己酸乙酯和苯甲醛、苯甲醛和丁酸乙酯的阈值，混合比例参照松子酒样品中香气物质的含量比例。通过校正公式计算校正值（式中：P为校正值；p为正确识别的概率），以lg（浓度）为横坐标，校正值P为纵坐标绘制曲线。通过公式进行拟合[15]。察觉阈值即为纵坐标P=0.5时对应的横坐标。

1.3 数据处理

通过Microsoft Office Excel 2016对所得数据进行整理计算，采用IBM SPSS Statistics 20.0分析软件对数据进行Duncan检验（P＜0.05），采用SIMCA进行OPLS-DA分析，通过TBtools进行聚类层次分析以及热图制作[16]。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME-GC-MS分析

将提取得到的松子酒香气物质与质谱数据库比较，将相似度超过85%的组分保留，结果如表1。

表1 3种松子酒样品中香气物质分析结果Table 1 Analysis results of aroma substances in three kinds of pine wines

续表1 3种松子酒样品中香气物质分析结果Continue table 1 Analysis results of aroma substances in three kinds of pine wines

如表1所示，共鉴定出69种香气物质，主要包括酯类、醇类、酸类、醛酮类、萜烯类及其他物质，这些物质共同构成了几种松子酒的独特风味。其中，松子酒1号鉴定出29种香气物质，松子酒2号鉴定出35种，松子酒3号鉴定出45种香气物质，可以发现不同松子酒中检测出的香气物质种类和数目具有差异。

在3种样品中均检测到酯类物质，含量分别达到11 966.76、28 079.49、14 788.33 μg/L，主要呈果香香气，部分物质还呈甜香、花香、脂肪香坚果香等香气，其中乙酸苯乙酯（玫瑰花香，带有粉香的蜂蜜样香气）、丁酸乙酯（菠萝香）、辛酸乙酯（白兰地酒香）、己酸乙酯（青苹果味）和L-乳酸乙酯（酒香）等酯类物质在松子酒中具有较高的含量，并且这些酯类在其他白酒中也具有较高的含量[17]。

醇类物质具有易挥发的物理性质，通过醇类的挥发对松子酒能够起到助香的作用，有效提高总体的风味香气[18～19]。3种松子酒中醇类物质分别达到2 379.81、2 426.85、15 917.35 μg/L，其中 2-苯乙醇（玫瑰香气）、正己醇（青草香，坚果油香）及异戊醇（奶油、油脂香味）等含量较高。

酸既有香气又是呈味物质，它们与醇类发生酯化反应生成酯类物质[20]。含酸量过大或过小都会影响酒的口感和风味，适量的酸在酒中能起到缓冲作用，协调口感，增进风味，酸还能促进酒的甜味感。其中松子酒2号含酸量达到5 082.75 μg/L，正己酸（椰肉油气味，辛辣的味道）为其主要酸味物质，含量5 041.64 μg/L。

醛和酮是白酒中的重要呈味物质，往往带有刺激感，能够有效提升风味，其碳链越长，刺激感越弱，表现出青草味及脂肪味等。其中苯甲醛具有苦杏仁味，可能是松子带来的独特风味。

大部分萜烯类物质的察觉阈值较低，对酒类风味的形成贡献很大。其中4-甲基愈创木酚（烟熏味）被认为是酱香型白酒中重要的香气物质[21]。

2.2 层次聚类分析及偏最小二乘判别分析

对3种松子酒香气物质的相对含量进行层次聚类分析，并结合热图进一步研究3种松子酒69种香气物质的分布规律[22]，结果如图1，相对含量的多少对应颜色的深浅，相对含量越多红色越深，相对含量越少蓝色越深[23]。

图1 3种松子酒香气物质聚类热图Fig.1 Cluster heat map of aroma substances in three kinds of pine wines

由图1可见，3种松子酒香气物质成分含量具有明显差异，可将特征香气成分分为4个系列，Ⅰ系列仅有3-糠醛和邻苯二甲酸二丁酯；Ⅱ系列（异戊醇～2-甲基-丁基-乙酸酯）以酯类为主，其中十四酸乙酯具有鸢尾香气，并带有油脂气，乙酸苯乙酯具有玫瑰花香，2号酒中棕榈酸乙酯（脂肪香坚果香）含量较高，可能是与其中的松籽品种为东北长白山特有百年红松之籽有关；Ⅲ系列（冰片～己酸异戊酯）以酯类为主，其中戊酸乙酯具有类似苹果的水果香，庚酸乙酯具有菠萝香气味，辛酸乙酯具有白兰地酒香味；在Ⅳ系列中（苯甲醛～α-荜澄茄醇），α-荜澄茄醇具有让人愉快的香味、辛辣微苦，苯甲醛具有苦杏仁及坚果香，其含量高可能与松子为云南松所产有关。

通过OPLS-DA模型进一步分析3种松子酒的差异，结果如图2。

图2 3种松子酒香气物质OPLS-DA的分数散点情况Fig.2 Score plot of OPLS-DA model of aroma substances in three kinds of pine wines

在OPLS-DA模型中R2X和R2Y代表模型对X和Y矩阵的解释能力，Q2表示模型的预测能力[24]。模型中R2X=0.986，R2Y=0.993，Q2=0.988，其中 R2X=0.986 表明该模型能反映98.6%数据的变化，R2和Q2均大于0.9，表明该模型具有较高的可解释度和预测能力。3种松子酒样品在得分图上聚类良好，组内差异性小，3种样品之间完全分离，存在一定差异性。

2.3 OAV值分析

松子酒的整体风味取决于不同香气物质的浓度，同时与物质的察觉阈值密不可分，不同品牌的松子酒有其独特的风味。由于不同香气物质的特征及阈值不同，对风味特征的贡献也存在差异，通过OAV进一步分析香气物质的作用，所用阈值参考《化合物香味阈值汇编（第二版）》[25]及文献[20，26-27]，结果如表2。

表2 3种松子酒中香气物质OAV值Table 2 Odor activity values of aroma substances detected in three kinds of pine wines

OAV≥1能被嗅觉感官所感知，OAV＜1通常起到修饰味道的作用，但由于不同物质间可能存在相互影响如协同、加成及掩盖等作用。因此对所有OAV大于0.01的香气物质均予以列出，如表2所示，3种松子酒中共有10种物质的OAV大于1，可能是主要香气物质，其中苯甲醛具有坚果香，可能为松子酒提供特有的坚果风味。

将松子酒按照风味特征分成6个系列，分别是玫瑰香、苹果香、坚果香、柠檬香、菠萝香和白兰地香，如表2依照各香气物质的OAV绘制香气轮廓图，见图3。

图3 不同品种松子酒香气轮廓图Fig.3 Aroma profiles of different pine wines

松子酒2号味道丰富，主要以苹果香、坚果香、菠萝香为主调，花香起补充作用，可能与基酒酿造方式和松子的品类有关。

2.4 关键香气物质间协同作用研究

松子酒中的香气物质包括酯类、醇类、酸类、醛酮类、萜烯类物质等，这些物质可通过相互作用使松子酒的香气复杂多变，由于不同化合物间可能存在相互影响如产生拮抗、协同、加成等作用。通过感官评定绘制S型曲线，进一步分析香气物质的协同作用，结果如图4。

图4 S型曲线法研究香气协同作用Fig.4 Synergistic effect of aroma by S-curve method

通过试验阈值与理论阈值的比值来表征香气物质间的相互作用，将比值计为R，R＞1时为掩盖作用，R=1时无作用，0.5＜R＜1时为加成作用，R≤0.5时为协同作用。理论阈值由 Feller加合公式：P（A+B）=P（A）+P（B）-P（A）P（B）得到[28]。

己酸乙酯、丁酸乙酯和苯甲醛的阈值检测结果见表 3，分别为 748.5、18 454.4、631.4 μg/L。松子酒中己酸乙酯、丁酸乙酯和苯甲醛两两混合后的阈值变化见图4、表3。己酸乙酯和丁酸乙酯混合后，阈值从2 171.2 μg/L（试验）变为 3 283.2 μg/L（理论），R=0.66，说明发生加成作用，香味加成。己酸乙酯和苯甲醛混合后，阈值从 1 664.2 μg/L 变为 904.7 μg/L，R=1.84，说明发生掩盖作用。丁酸乙酯和苯甲醛混合后，阈值从 2 090.3 μg/L 变为 3 426.1 μg/L，R=0.61，说明发生加成作用。

表3 S型曲线法研究香气物质间的相互作用Table 3 Interaction between aroma substances by S-curve method

3 结论

通过HS-SPME结合GC-MS从3种松子酒中分离出69种主要香气物质，其中松子酒1号29种，松子酒2号35种，松子酒3号45种，主要包括酯类、醇类及醛酮类化合物。聚类分析及OPLS-DA结果均表明3种松子酒组内无显著差异，组间香气物质含量存在差异。

根据香气物质的OAV值，从松子酒中筛选出10种关键香气物质，其中苯甲醛（苦杏仁味）、己酸乙酯（苹果味）、丁酸乙酯（菠萝味）及戊酸乙酯（苹果味）具有较高的OAV值，为松子酒中的特征香气物质。在OAV值基础上，通过S型曲线法对其中OAV值较高的3种香气物质己酸乙酯、苯甲醛、丁酸乙酯及混合物测定阈值，利用Feller加和模型进一步分析协同作用，研究表明，丁酸乙酯与己酸乙酯、苯甲醛混合后发生加成作用，己酸乙酯与苯甲醛混合后发生掩盖作用，为进一步控制松子酒香气品质提供了基础。