酶解麦胚制备风味活性肽的研究

赵原，金艳，张民

（天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室食品科学与工程学院，天津 300457）

小麦作为我国重要的粮食作物，其加工副产物小麦胚芽约占小麦籽粒的3%，其蛋白质含量约30%，具有明显的资源优势和营养价值[1]。然而，目前小麦胚芽主要作为饲料广泛应用于养殖业，产品附加值较低，造成了极大的资源浪费[2]。

活性肽一般含有2个～20个氨基酸，分子量小于6 000 Da，具有良好的生物活性，包括抗氧化、抗高血压、抗血栓、抗菌和抗炎作用等[3-4]。与传统药物相比，活性肽具有易吸收、低毒、高效的竞争优势，在制药领域有非常好的应用前景。目前常用的制备方法包括发酵和酶解。同时，肽类物质也具有一定的食品风味特性，如呈鲜和增甜。从食物蛋白中提取或者通过氨基酸合成得到的分子量低于3 000 Da的呈味肽，因在天然食品以及加工食品中产生鲜明的特征滋味而引起人们的广泛关注，已有多项研究从禽畜肉类、水产品、豆类等各种食物中制备获得呈味肽[5]。相比于传统的调味剂，呈味肽具有低热量、天然健康的特性，具有非常好的开发前景和应用价值。因此，本研究以脱脂麦胚为原料，将风味与营养相统一，研究和开发具有生物活性的麦胚风味肽，为提高小麦副产物综合利用附加值、提升粮食资源综合利用率提供新的思路，具有广阔的市场前景和研究价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂小麦胚芽（蛋白含量约为30%）：河南省鲲华生物技术有限公司。

风味蛋白酶（食品级）：诺维信（中国）生物技术有限公司；浓盐酸、浓硫酸（均为分析纯）：天津市化学试剂一厂；无水乙醇、氢氧化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美国Sigma公司；2，2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐[2，2'-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海麦克林生化科技有限公司；草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、抑菌酶、杆菌肽、乙氨酰-乙氨酰-乙氨酸（标准品）：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；5'-尿嘧啶核苷酸、5'-鸟嘌呤核苷酸、5'-次黄嘌呤核苷酸、5'-腺嘌呤核苷酸（标准品）：坛墨质检标准物质中心。

1.2 仪器与设备

电子分析天平（AB204-N）：上海精科实业有限公司；电热鼓风干燥箱（GZX-9070MBE）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；数显式电热恒温水浴锅（XMTD-204）：天津欧诺仪器仪表有限公司；pH计（DHSJ-3F）：上海仪电科学仪器股份有限公司；酶标仪（Synergy HTX）：美国伯腾仪器有限公司；氨基酸分析仪（L 8900）：日立公司；气相色谱质谱联用仪（ISQ 7000）、真空冷冻干燥机（MODULYOD-230）：赛默飞世尔科技公司；离心机（TDZ5-WS）：长沙湘仪离心机仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解麦胚单因素试验

以脱脂小麦胚芽粉为原料，用磷酸盐缓冲溶液配制一定底物浓度的麦胚溶液，磁力搅拌器调浆5min，95℃水浴10 min后冷却至酶解温度，加入风味蛋白酶，酶解3 h。经90℃水浴灭酶15 min后离心（3 500 r/min、20 min），上清液冷冻干燥后备用。参考张玲等[6]的方法配制双缩脲试剂测定酶解物中肽含量，并计算麦胚肽得率。单因素试验设计如下。

固定酶解温度为50℃，酶添加量4%，底物浓度4%，以麦胚肽得率为指标，选取酶解pH值为4、5、6、7、8，考察酶解pH值对酶解制备麦胚肽的影响。

固定酶解pH值为6，酶添加量4%，底物浓度4%，以麦胚肽得率为指标，选取酶解温度30、40、50、60、70℃，考察酶解温度对酶解制备麦胚肽的影响。

固定酶解pH值为6，酶解温度为50℃，底物浓度4%，以麦胚肽得率为指标，选取酶添加量2%、3%、4%、5%、6%，考察酶添加量对酶解制备麦胚肽的影响。

固定酶解pH值为6，酶解温度为50℃，酶添加量4%，以麦胚肽得率为指标，选取底物浓度2%、3%、4%、5%、6%，考察底物浓度对酶解制备麦胚肽的影响。

1.3.2 感官品评

将酶解物配制为10 mg/mL样液并经121℃灭菌20 min，选择经过培训的10名感官评定员（5男5女，年龄20岁～30岁）组成感官评定小组对其进行品评，感官评分标准如表1所示。

表1 感官评分标准Table 1 Standard of sensory evaluation

1.3.3 挥发性风味物质的测定

参考孙浩然[7]的方法，选择顶空固相微萃取技术对酶解物气味进行收集，再利用气相色谱质谱联用仪进行鉴定。

1.3.4 游离氨基酸含量的测定

参考吴阳[8]的方法稍作改动，称取适量样品充分溶解于超纯水后与10%磺基水杨酸以3∶1的体积比混匀，于4℃下静置1 h后反复低温离心（10 000 r/min，10 min），取上清液，经0.22 μm水膜过滤后上机进行测定。

1.3.5 呈味核苷酸含量的测定

参考吕丽等[9]的方法，稍作改动，采用高效液相色谱法，色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH4.6）与甲醇的体积比97∶3；柱温30℃；进样量20μL；检测波长254 nm；流速0.6 mL/min。样品经0.22 μm微孔滤膜过滤后进样测定，同时利用标准品的出峰时间及峰面积做线性回归方程。

1.3.6 有机酸含量的测定

参考GB 5009.157—2016《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》[10]，采用高效液相色谱法进行有机酸的测定。

1.3.7 肽分子量分布的测定

参考张佳男[11]的方法，稍作改动，采用高效液相色谱法，色谱条件：TSK-gel 2000 SWXL色谱柱（7.8 mm×30 cm）；流动相为乙腈-水-三氟乙酸体积比20∶80∶0.1；柱温30 s；流速0.5 mL/min。进样前用0.22 μm微孔滤膜过滤。以标准品的保留时间和相对分子质量的对数做线性回归方程。

1.3.8 超滤分离

将酶解物配制成一定浓度的溶液，依次使用截留量为10000Da和3000Da的超滤管，然后以8000 r/min在4℃下离心15 min，收集各组分滤液，-80℃冷冻干燥，保存备用。

1.3.9 DPPH自由基清除能力的测定

参考Wang等[12]的方法，取一定体积的不同浓度样品水溶液，加入等体积0.1 mmol/L DPPH的无水乙醇溶液，混匀，室温避光反应30 min后在517 nm处测得各吸光度，以相同质量浓度的抗坏血酸做对照试验。DPPH自由基清除率用以下公式计算。

式中：A为样品+0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液的吸光度；A0为样品+无水乙醇溶液的吸光度；A1为水+0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液的吸光度；A2为水+无水乙醇溶液的吸光度。

1.3.10 ABTS＋自由基清除能力的测定

参考Chen等[13]的方法，将等体积7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L过硫酸钾溶液混匀，室温避光反应12 h～16 h后取一定体积混合液经无水乙醇稀释得到ABTS工作液，使其室温避光放置30 min后在734 nm处的吸光度为0.70±0.02。取40 μL待测液和160 μL ABTS工作液于96孔酶标板反应，测定其在734 nm处的吸光度，以相同质量浓度的抗坏血酸做对照试验。ABTS＋自由基清除率用以下公式计算。

式中：A0为水+ABTS工作液的吸光度；A1为样品+ABTS工作液的吸光度；A2为样品+水的吸光度。

1.3.11 羟自由基清除能力的测定

参考朱楚楚[14]的方法，依次向试管中加入1.0 mL 6.0 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液、1.0 mL 6 mmol/L的硫酸亚铁溶液和1.0 mL样品溶液，最后加1.0 mL 6 mmol/L的过氧化氢溶液启动反应，摇匀后在37℃水浴反应30 min，测定其在510 nm波长处的吸光度，以相同质量浓度的抗坏血酸做对照试验。羟自由基清除率用以下公式计算。

式中：A0为硫酸亚铁+过氧化氢+水+水杨酸的吸光度；A1为硫酸亚铁+过氧化氢+样品+水杨酸的吸光度；A2为硫酸亚铁+水+样品+水杨酸的吸光度。

1.3.12 还原力的测定

参考赵寒青[15]的方法，取不同浓度的样品溶液各1 mL，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH6.6）和2.5 mL质量分数为1%的亚铁氰化钾溶液，涡旋30 s，在50℃水浴条件下反应20 min，迅速冷却后加入2.5 mL质量分数为10%的三氯乙酸溶液终止反应，混匀离心（3 000 r/min，10 min），取上清液 2.5 mL于试管，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL质量分数为0.1%的氯化铁溶液后再次混匀，室温避光放置10 min后于700 nm处测其吸光度，以相同质量浓度的抗坏血酸做对照试验。

1.4 数据分析

所有试验平行进行3次，试验结果以平均值±标准差表示。利用Origin 2019b、GraphPad Prism 8和IBM SPSS Statistics 26进行数据分析和图表绘制。

2 结果与分析

2.1 风味蛋白酶酶解麦胚的单因素试验结果

2.1.1 酶解pH值对麦胚肽得率和风味的影响

酶解pH值对麦胚肽得率和风味的影响如图1所示。

图1 酶解pH值对麦胚肽得率和风味的影响Fig.1 Effects of pH value of enzymatic hydrolysis on the yield and flavor of wheat germ peptides

在不同酶解pH值条件下利用风味蛋白酶进行麦胚酶解，麦胚肽得率有显著差异，随着酶解pH值的提高，肽得率呈现一个先上升后趋于平缓的趋势，在pH值为7时达到最大，此时麦胚肽得率为（6.11±0.14）%。同时，感官评分结果表明，酶解pH值的改变对酶解物的咸味和香味有一定影响，且均无异味产生，这可能是由于酶解pH值影响美拉德反应程度的不同从而生成不同风味物质。当酶解pH值为7时呈现一定的咸鲜风味和较好的香气，因此选择酶解pH7为最佳。

2.1.2 酶解温度对麦胚肽得率和风味的影响

酶解温度对麦胚肽得率和风味的影响如图2所示。

图2 酶解温度对麦胚肽得率和风味的影响Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on the yield and flavor of wheat germ peptides

当酶解温度由30℃升高到70℃，麦胚肽得率呈现先升高后降低的趋势，在50℃时达到最大。其原因可能是风味蛋白酶活性在30℃～50℃范围内随着温度的升高而提高，蛋白水解度逐渐上升，而当温度大于60℃时酶活受到抑制导致水解度下降。结合感官评分结果，酶解温度在50℃和60℃时酶解物表现出较好的香气和鲜味，因此选择50℃为最佳酶解温度。

2.1.3 酶添加量对麦胚肽得率和风味的影响

酶添加量对麦胚肽得率和风味的影响如图3所示。

图3 酶添加量对麦胚肽得率和风味的影响Fig.3 Effects of enzyme addition on the yield and flavor of wheat germ peptides

随着蛋白酶添加量的增大，麦胚肽得率不断提高，当酶添加量大于4%时，麦胚肽得率有所下降并逐渐趋于平缓，可能是反应中的酶达到一定含量时，酶与底物的反应过剩导致反应速度变小，继续增大酶添加量，反应体系中的水解度的变化已经不明显。结合感官评分结果，在酶添加量介于3%～6%时，酶解物有一定的咸鲜风味，其它味觉感官不突出，但整体呈现一定香气。综合上述情况，选择4%为最佳酶添加量。

2.1.4 底物浓度对麦胚肽得率和风味的影响

底物浓度对麦胚肽得率和风味的影响如图4所示。

图4 底物浓度对麦胚肽得率和风味的影响Fig.4 Effects of substrate concentration on the yield and flavor of wheat germ peptides

底物浓度过高，体系的流动性变差，使底物蛋白与酶分子之间的相互运动减弱，降低底物蛋白与酶分子的碰撞概率，进而反应速度减慢；其次，体系中的底物蛋白会在酶的活性位点积累，形成无活性的中间产物，从而抑制水解反应[16]。由图4可以看到，随着底物浓度的增加，多肽的得率呈现显著下降的趋势。同时，当底物浓度为2%时，鲜、咸味较为突出，其它味觉感官不突出，且呈现一定香气。综合上述情况，选择2%为最佳底物浓度。

2.2 挥发性风味物质的测定

酶解物中挥发性风味物质的测定结果如表2所示。

表2 酶解物中挥发性风味物质的测定Table 2 Determination of volatile flavor substances in the hydrolysate

经过对比特征挥发性化合物的保留时间和迁移时间，对酶解物的挥发性风味成分进行定性分析，得到27种化合物，其中包括5种醇类、2种醛类、2种酯类、3种酸类、1种酚类、1种酮类、11种烃类和2种杂环类，这些化合物构成了酶解物的挥发性风味轮廓。其中，烃类物质的含量最高，其次是醇类和酸类。烃类化合物可能是由脂肪氧化降解产生的，且大部分烃类物质香气较弱或无气味[17-18]。压榨后，麦胚中的油脂不能完全去除，因此，醇类物质可能是由于脱脂麦胚残油中的不饱和脂肪酸被氧化酶氧化，再被裂解酶或氧化还原酶催化生成[19]。醇类一般具有令人愉悦的气味，苯乙醇是我国规定允许使用的食用香料，具有清甜的玫瑰样香气。不饱和醇类的阈值较饱和醇低，对风味贡献大[20]。酸类物质是酯类化合物合成的前体物质之一，可以由氨基酸降解后通过氧化或还原作用产生，也可通过饱和脂肪酸自身氧化降解产生[21]。正己酸、乙酸和辛酸整体上表现出不愉快的香气。除此之外，醛类和酯类物质也为产物提供了较好的花果样香气。其中，醛类物质主要来自脂肪的氧化分解或者美拉德反应，阈值较低，对气味形成的贡献较大[22-24]。酯类物质由醇和羧酸酯化而成，通常为食物提供良好的香气[25]，如γ-壬内酯有浓郁椰子香气，常用于调配食用香精。

2.3 游离氨基酸含量的测定

酶解物中游离氨基酸含量如表3所示。

表3 酶解物中游离氨基酸的含量Table 3 Content of free amino acids in the hydrolysate

氨基酸间的相互作用对酶解物的风味有一定的影响[19]。根据对游离氨基酸滋味特征的描述，游离氨基酸呈味特征以鲜味、甜味、苦味为主[26]，对酶解物中的游离氨基酸的含量进行测定，可以发现鲜味氨基酸和甜味氨基酸的含量远低于其阈值，苦味氨基酸中尤其以精氨酸的含量较高，达到10.132 mg/g，这可能是由于过度的酶解，肽中的疏水性氨基酸逐渐暴露在侧链的外面，是酶解物呈苦味的原因之一[19]。

2.4 呈味核苷酸含量的测定

酶解物中呈味核苷酸含量如表4所示。

表4 酶解物中呈味核苷酸的含量Table 4 Content of flavoring nucleotides in the hydrolysate

呈味核苷酸的含量与酶解物的风味密切相关，其中AMP、GMP和IMP是鲜味的重要贡献者，并与游离氨基酸存在协同作用[27]。相关研究分析了酶解物中UMP、GMP、IMP、AMP的含量。GMP和IMP是主要的呈鲜味核苷酸，其阈值分别为0.2 mg/g和1.8 mg/g[28-29]。其中，在酶解物中检出GMP含量为（0.143±0.026）mg/g。

2.5 有机酸含量的测定

酶解物中有机酸含量如表5所示。

表5 酶解物中有机酸的含量Table 5 Content of organic acids in the hydrolysate

有机酸是主要的酸味物质成分，其酸性源于羧基，其含量和种类对产品的风味特性起到非常重要的作用。有机酸会影响感官特性，不仅能通过自身酸味调节口腔对其它滋味的感知，又能通过影响体系pH值来调控滋味物质之间的交互作用，从而影响消费者对产品的接受程度[30-31]。有机酸可分为挥发酸和不挥发酸，不挥发酸包括酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸等。其中，酶解物中的酒石酸和琥珀酸的含量相对较高，是主要呈味有机酸。

鲜味作为第5种基本味觉，是由鲜味物质与受体结合产生的味觉感受，根据化学结构的差异性，鲜味物质可分为氨基酸及其盐类、核苷酸类、有机酸类、肽类等[32]。琥珀酸及其钠盐作为有机酸类，被认定属于鲜味物质，贡献了特殊的鲜味和酸味[33-34]。琥珀酸的阈值为10.6 mg/100 g，在不同的浓度下，琥珀酸会产生强烈的咸味和苦味[35]。

2.6 肽分子量分布的测定

酶解物中肽分子量分布如表6所示。

表6 酶解物中肽分子量分布Table 6 Molecular weight distribution of peptides in the hydrolysate

酶解物中肽分子量主要分布在小于3 000 Da的部分，占总量的（63.93±1.23）%，其次是 3 000 Da～10 000 Da和大于10 000 Da的部分。有研究表明，呈味肽的分子量主要集中在3 000 Da以下[5]，因此，后续试验重点研究部分是分子量小于3 000 Da的酶解物。

2.7 抗氧化活性研究

对分子量小于3000Da酶解物的DPPH自由基清除率、ABTS＋自由基清除率、羟自由基清除率和还原力进行测定，以抗坏血酸为阳性对照，结果如图5～图8所示。

图5 DPPH自由基清除能力的测定Fig.5 Measurement of DPPH free radical scavenging ability

图6 ABTS＋自由基清除能力的测定Fig.6 Measurement of ABTS＋free radical scavenging ability

图7 羟自由基清除能力的测定Fig.7 Measurement of hydroxyl free radical scavenging ability

图8 还原力的测定Fig.8 Determination of reducing power

在浓度为0.1 mg/mL～10.0 mg/mL时，分子量小于3 000 Da的酶解物的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羟自由基清除率和还原力都随着浓度的增加而增加。其中，分子量小于3 000 Da的酶解物的DPPH自由基清除能力（IC50值为10.327 mg/mL）和还原力相对较弱，远低于同浓度下的抗坏血酸。在浓度为10.0 mg/mL时，分子量小于3 000 Da的酶解物对ABTS+自由基的清除能力只略低于抗坏血酸，分别为92.22%和99.67%，IC50值为0.448 mg/mL。相同浓度下，分子量小于3 000 Da的酶解物对羟自由基的清除能力也只略低于抗坏血酸，分别为95.51%和99.93%，IC50值为0.574 mg/mL。总体而言，分子量小于3 000 Da的酶解物具有较好的体外抗氧化活性。

3 结论

通过单因素试验优化风味蛋白酶酶解麦胚制备风味活性肽的工艺参数，并对酶解物中风味物质含量、肽分子量分布及其体外抗氧化活性进行了测定。结果表明，麦胚最佳酶解条件为pH7，底物浓度2%，酶解温度50℃，酶添加量4%，此时麦胚肽得率达到（8.17±0.70）%。在此工艺条件下，酶解物中的挥发性风味物质以烃类、酸类和醇类物质为主，主要呈鲜物质天冬氨酸的含量为0.936 mg/g，5'-鸟嘌呤核苷酸的含量为（0.143±0.026）mg/g，琥珀酸的含量为（18.75±2.45）mg/g，使酶解物整体表现出一定的咸鲜滋味并伴有清淡的香气。同时，体外抗氧化试验结果表明分子量小于3 000 Da的酶解物的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羟自由基清除率的IC50值分别为 10.327、0.448、0.574 mg/mL，表现出较好的抗氧化活性。综上，本文所制备的麦胚酶解物兼具良好的风味特性和抗氧化活性，为充分开发优质资源小麦胚芽，提高小麦副产品的市场化应用，促进营养健康食品产业的发展提供参考。