达格列净对非糖尿病慢性心力衰竭兔的心功能及心肌重构影响

陈学锋，赵明，张瑜，郝自强，白文楼，孟存良，齐晓勇△

心力衰竭（HF）是多种原因引起心脏结构和（或）功能的异常改变，进而导致心室收缩和（或）舒张功能发生障碍。尽管HF 的治疗近年来取得较大进展，但患者病死率和再住院率仍较高［1］。钠葡萄糖共转运蛋白2（SGLT2）抑制剂（SGLT2i）是一种新型降糖药物，通过抑制肾脏近曲小管介导葡萄糖重吸收的SGLT2 而促进葡萄糖从尿液中排出。关于SGLT2i 心血管安全性的研究显示SGLT2i 可以减少主要不良心血管事件和降低心力衰竭再住院风险，且此获益的出现时间明显早于降糖作用所致获益的时间，表明其机制可能并非通过降糖所致［2-4］。对非糖尿病患者亚组的分析结果显示，SGLT2i达格列净仍可降低主要心血管事件包括因心血管疾病死亡、心力衰竭再住院及心力衰竭急性发作的发生率［5］。鉴于上述研究结果，2021年欧洲急性和慢性心力衰竭诊断和治疗指南将达格列净和恩格列净列为射血分数降低的HF 患者治疗的Ⅰ类推荐以降低心力衰竭患者住院和死亡的风险［6］。然而，目前有关其改善心力衰竭患者预后的主要机制方面的研究较少，尚未达成共识。本研究采用升主动脉缩窄法建立非糖尿病慢性心力衰竭兔模型，探讨达格列净对其心功能的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 18 只6 月龄普通级健康成年雄性新西兰大白兔，体质量3.0～3.5 kg，购自河北省望都县彤辉养殖有限公司，许可证号：SCXK（冀）2016-002。实验动物均于河北省人民医院临床医学研究中心动物室单笼饲养，室温（17±3）℃，摄水摄食不限。

1.2 主要试剂和仪器 戊巴比妥钠、4%多聚甲醛购自北京索莱宝公司；生理盐水购自石家庄四药有限公司；青霉素钠购自华北制药有限公司，达格列净（10 mg/片）购自阿斯利康制药有限公司；兔N端前脑钠肽（NT-proBNP）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司；胶原纤维（Collagen）Ⅰ、CollagenⅢ抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。EPIQ7 超声诊断系统购自美国Philip 公司，光学显微镜购自日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组及模型建立 将18只大白兔按随机数字表法分为假手术组、心力衰竭组和达格列净组，每组6只。兔经3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉后仰卧位固定于动物手术台上，取胸骨左缘第二、三肋间，逐层切开胸部组织，暴露升主动脉。假手术组只开胸不手术，心力衰竭组和达格列净组开胸后，以丝线标记并使用游标卡尺精确测量升主动脉周长，在距离升主动脉根部以远1.0 cm处结扎升主动脉，使缩窄后周长为原周长的60%。逐层关胸至皮肤。术后常规青霉素80万单位肌内注射3 d。术后12周行超声心动图检查，以左心室射血分数（LVEF）≤0.40 视为心力衰竭模型制作成功。术后13周，达格列净组满足上述心力衰竭标准的实验动物经强饲法予以达格列净1 mg/（kg·d），假手术组及心力衰竭组给予等量生理盐水经口强饲，共干预10 周。对各组动物的精神、活动及进食等一般情况进行观察。

1.3.2 超声心动图检查 分别于术前、术后12周、干预10周后对各组动物行超声心动图检查，测定室间隔厚度（IVS）、左心室舒张末内径（LVEDD）、左心室后壁厚度（LVPW）、左心室收缩末内径（LVESD）和LVEF。以上各测量值均取连续3次测量的平均值。

1.3.3 血液学指标检测 药物干预10周后，从各组兔耳缘静脉取血3～4 mL，使用全自动血细胞分析仪检测兔血白细胞计数、血红蛋白含量。使用生化分析仪检测总蛋白、白蛋白、钾、钠、随机血糖、血浆渗透压水平。分别于术后12周及药物干预10 周后，经耳缘静脉取血，使用ELISA 法测定各组NTproBNP水平。

1.3.4 体质量和心脏质量测量 药物干预10周后，测量各组实验动物体质量。处死动物后取出心脏精确测量全心质量，剪去左心房、右心房及右心室后测量左心室质量，并计算左心室质量/体质量比值。

1.3.5 病理学染色 实验末处死实验动物，取左心室前壁近心尖处心肌组织于4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，生物切片机切取4µm 厚组织切片，行HE 染色观察心肌细胞形态；Masson染色观察心肌纤维化程度，染色结果中胶原纤维呈蓝色，细胞质、肌纤维、红细胞呈红色；免疫组化染色观察心肌组织CollagenⅠ、CollagenⅢ表达水平，其蛋白阳性表达产物呈棕黄色颗粒。应用Image J 软件分析图像，计算胶原组织分数（心肌纤维化面积/心肌组织面积×100%）以及CollagenⅠ或CollagenⅢ阳性面积百分比（CollagenⅠ或CollagenⅢ阳性面积/心肌组织面积×100%）。

1.4 统计学方法 使用SPSS 26.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布的数据使用±s表示，方差齐时多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey检验；若方差不齐，多组间比较采用Welch 方差分析，组间多重比较使用Games-Howell 检验，组内干预前后NT-proBNP 比较使用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般情况 假手术组6只大白兔均存活至实验结束；心力衰竭组和达格列净组术中、术后无死亡。术后12周经超声心动图筛选，心力衰竭组和达格列静组各5只符合实验标准，并存活至实验结束。所有动物术后均出现食欲减退、精神萎靡、活动减少、呼吸急促；假手术组术后3 d上述症状逐渐恢复；心力衰竭组从术后3 d始上述症状亦有所好转，至实验结束；心力衰竭组的精神状态、活动情况均较假手术组差，达格列净组一般情况介于心力衰竭组和假手术组之间。

2.2 各组超声心动图检查结果比较 各组术前IVS、LVEDD、LVPW、LVESD、LVEF 比较差异均无统计学意义。术后12 周，与假手术组相比，心力衰竭组和达格列净组LVESD 增加，LVEF 降低（P＜0.05），而心力衰竭组和达格列净组差异无统计学意义。药物干预10 周，达格列净组LVEF 较心力衰竭组明显升高，且较术后12 周明显升高（t=7.140，P＜0.05）。见表1。

2.3 各组血液学指标比较 3 组间白细胞计数、总蛋白、白蛋白、血清钾、钠、随机血糖、血浆渗透压比较差异均无统计学意义。与假手术组相比，心力衰竭组及达格列净组血红蛋白降低（P＜0.01），达格列净组与心力衰竭组血红蛋白差异无统计学意义。见表2。

Tab.1 Comparison of cardiac ultrasound results before operation,12 weeks after operation and 10 weeks after drug intervention between the three groups表1 各组术前、术后12周及药物干预10周心脏超声结果比较 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与假手术组比较；b与心力衰竭组比较；c与术后12周比较，P＜0.05。

组别假手术组心力衰竭组达格列净组F n 6 5 5术前IVS（mm）2.83±0.09 3.02±0.29 2.89±0.14 1.317 LVEDD（mm）13.05±1.27 12.88±0.85 13.19±3.12 0.032 LVPW（mm）2.77±0.19 3.02±0.17 2.71±0.28 2.840 LVESD（mm）7.97±0.85 7.88±0.51 8.33±2.29 0.149 LVEF 0.73±0.04 0.74±0.02 0.71±0.05 0.427组别假手术组心力衰竭组达格列净组F术后12周IVS（mm）2.81±0.11 2.97±0.17 3.09±0.21 7.436 LVEDD（mm）13.18±1.33 13.16±0.78 12.70±1.20 0.295 LVPW（mm）2.79±0.09 2.91±0.24 2.84±0.06 7.459 LVESD（mm）8.29±0.87 11.02±0.61a 10.62±0.99a 17.235＊＊LVEF 0.71±0.02 0.38±0.01a 0.38±0.01a 1 326.354＊＊组别假手术组心力衰竭组达格列净组F药物干预10周IVS（mm）2.92±0.17 2.92±0.17 2.79±0.30 0.594 LVEDD（mm）12.07±1.16 13.24±1.81 12.86±2.84 0.496 LVPW（mm）2.79±0.09 2.79±0.10 2.71±0.23 7.578 LVESD（mm）7.65±0.71 11.16±1.54a 9.55±2.57 5.713＊LVEF 0.71±0.03 0.37±0.02a 0.56±0.06abc 120.097＊＊

Tab.2 Comparison of blood indexes between the three groups表2 各组血液学指标比较 （±s）

Tab.2 Comparison of blood indexes between the three groups表2 各组血液学指标比较 （±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，P＜0.05。

组别假手术组心力衰竭组达格列净组F n 6 5 5白细胞计数（×109/L）8.59±1.59 8.86±1.96 8.92±1.16 0.069血红蛋白（g/L）129.83±4.71 116.40±7.44a 116.80±2.17a 12.174＊＊总蛋白（g/L）60.18±7.65 61.62±4.51 58.94±4.50 0.257白蛋白（g/L）38.02±3.41 39.96±2.25 38.32±1.89 0.804组别假手术组心力衰竭组达格列净组F钾（mmol/L）4.62±0.46 4.14±0.34 4.54±0.25 2.520钠（mmol/L）143.17±1.47 143.00±1.58 141.60±1.14 1.927随机血糖（mmol/L）6.13±0.50 6.08±0.28 6.38±0.42 0.757血浆渗透压（mOsm/L）305.81±3.58 307.88±3.38 304.09±5.10 1.084

2.4 各组NT-proBNP 比较 术后12 周，心力衰竭组和达格列净组NT-proBNP 水平较假手术组均明显升高（P＜0.05），而达格列净组和心力衰竭组间差异无统计学意义。药物干预10周，心力衰竭组NTproBNP 水平较术后12 周升高，达格列净组NTproBNP 水平较术后12 周下降，但仍高于假手术组，而较心力衰竭组则明显降低（P＜0.05）。见表3。

Tab.3 Comparison of NT-proBNP levels 12 weeks after operation and 10 weeks after drug intervention between the three groups表3 各组术后12周及药物干预10周NT-proBNP水平比较 （ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of NT-proBNP levels 12 weeks after operation and 10 weeks after drug intervention between the three groups表3 各组术后12周及药物干预10周NT-proBNP水平比较 （ng/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 与假手术组比较，b 与心力衰竭组比较，P＜0.05。

组别假手术组心力衰竭组达格列净组F n6 5 5术后12周99.88±12.80 366.97±42.66a 379.56±59.55a 81.864＊＊药物干预10周104.40±9.72 449.70±21.26a 298.55±14.31ab 692.032＊＊t 0.900 3.824＊2.887＊

2.5 各组体质量及心脏质量比较 心力衰竭组较假手术组心脏外形增大、变形，达格列净组心脏外形较假手术组增大，但明显小于心力衰竭组，见图1。各组体质量差异无统计学意义。心力衰竭组的全心质量、左心室质量以及左心室质量/体质量较假手术组明显升高（P＜0.05），而达格列净组上述指标均低于心力衰竭组（P＜0.05），与假手术组相比，达格列净组全心质量、左心室质量以及左心室质量/体质量差异无统计学意义。见表4。

Tab.4 Comparison of body weight and heart weight between the three groups表4 各组体质量及心脏质量比较 （±s）

Tab.4 Comparison of body weight and heart weight between the three groups表4 各组体质量及心脏质量比较 （±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与心力衰竭组比较，P＜0.05。

组别假手术组心力衰竭组达格列净组F n 6 5 5体质量（kg）3.58±0.17 3.49±0.23 3.45±0.19 0.639全心质量（g）7.78±0.83 12.31±1.21a 8.31±0.26b 6.700＊＊左心室质量（g）6.05±0.62 9.74±1.17a 6.56±0.27b 7.069＊＊左心室质量/体质量（g/kg）1.69±0.22 2.79±0.39a 1.84±0.07b 6.621＊＊

2.6 各组心脏病理染色结果 HE染色示假手术组心肌纤维排列有序，细胞形态一致，胞质染色均匀；而心力衰竭组心肌纤维粗大，心肌细胞排列不整齐，心肌细胞间连接松散；与假手术组比较，达格列净组心肌细胞增粗，但较心力衰竭组明显改善，见图2。Masson 染色示假手术组心肌组织胶原纤维含量较少，而心力衰竭组胶原纤维明显增多，达格列净组心肌组织胶原纤维较心力衰竭组明显减少，见图3。心力衰竭组胶原组织分数高于假手术组，而达格列净组胶原组织分数则较心力衰竭组明显降低（P＜0.05），见表5。免疫组化染色显示，与假手术组相比，心力衰竭组心肌组织中CollagenⅠ及CollagenⅢ阳性表达产物明显增加，达格列净组CollagenⅠ及CollagenⅢ阳性表达产物比心力衰竭组明显减少，见图4、5。心力衰竭组CollagenⅠ、CollagenⅢ阳性面积百分比均明显高于假手术组，而达格列净组心肌组织CollagenⅠ、CollagenⅢ阳性面积百分比较心力衰竭组降低（P＜0.05），见表5。

Fig.1 Cardiac shape of each group图1 各组心脏外形

Fig.2 HE staining of myocardial tissue in each group(×200)图2 各组心肌组织HE染色（×200）

Fig.3 Masson staining of myocardial tissue in each group(×200)图3 各组心肌组织Masson染色（×200）

Fig.4 Collagen Ⅰimmunohistochemical staining of myocardial tissue in each group(×200)图4 各组心肌组织CollagenⅠ免疫组化染色（×200）

Fig.5 Collagen Ⅲimmunohistochemical staining of myocardial tissue in each group(×200)图5 各组心肌组织CollagenⅢ免疫组化染色（×200）

Tab.5 Comparison of myocardial collagen tissue fraction and positive area percentages of Collagen Ⅰ,Collagen Ⅲbetween the three groups表5 各组心肌胶原组织分数和CollagenⅠ、CollagenⅢ阳性面积百分比比较

3 讨论

目前有研究［7-8］认为，SGLT2i保护心脏的机制可能与降低血糖和体质量、减轻炎症反应、改善贫血、改善心脏能量代谢等因素相关。但具体机制并未达成一致。SGLT2i 恩格列净可通过抑制糖尿病小鼠心肌纤维化而改善心脏结构和功能，其机制可能与激活核转录因子E2/抗氧化反应原件（Nrf2/ARE）通路及抑制转化生长因子β（TGFβ）/SMAD 通路有关［9］。Santos-Gallego 等［10］研究显示，恩格列净可以促使心肌从主要利用葡萄糖供能转向主要利用酮体、游离脂肪酸和支链氨基酸以增加心肌腺苷三磷酸含量，改变心肌能量代谢，改善非糖尿病猪缺血性心力衰竭的左心室重构，增强左心室收缩功能。Lee等［11］使用球囊扩张导管对高胆固醇饲料喂养的非糖尿病新西兰大白兔腹主动脉扩张并损伤后，使用达格列净或安慰剂干预8 周，结果显示达格列净可以通过抑制炎症反应和巨噬细胞活性发挥抗动脉粥样硬化作用。体外研究表明，恩格列净可以抑制心脏成纤维细胞（CF）产生细胞基质CollagenⅠ，并抑制α-平滑肌肌动蛋白、组织生长因子和基质金属蛋白酶等促纤维化标志物的表达［12］。而目前有关SGLT2i对心肌重构的研究较少。

心肌重构在慢性心力衰竭的进展中起着非常重要的作用并且与预后密切相关［13］。心肌重构包括心脏几何形状和功能的改变，体现为LVEF 降低和左心室体积或质量增加［14］。心脏大小、形状的改变可预测心力衰竭的预后并评估对治疗的反应［15-16］。左心室质量与体质量的比值称为左心室质量指数，左心室质量指数较单纯的左心室质量更能反映心肌重构的程度，也可预测心力衰竭的长期预后［17］。本研究采用主动脉缩窄法建立非糖尿病兔心力衰竭模型，其病理生理改变类似于高血压性心力衰竭患者。结果显示，与假手术组相比，心力衰竭组LVEF 降低，NT-proBNP升高，心脏外形增大、细胞连接松散，全心质量、左心室质量以及左心室/体质量比值均明显增加，使用达格列净干预10 周，可改善动物心力衰竭相关症状，提高LVEF 并降低NT-proBNP，与临床研究结果一致［18］。进一步研究显示，达格列净可减轻心脏外形增大，降低全心质量、左心室质量和左心室质量指数，表明其可通过抑制心力衰竭动物心肌重构来改善预后。

心肌纤维化是心肌重构的重要机制之一，其主要特征是心肌中细胞外基质（ECM）的过度沉积，心肌纤维化的程度与左心室功能受损的程度密切相关［19］。心脏ECM 主要由CollagenⅠ和CollagenⅢ组成［20］。CollagenⅠ约占心肌胶原蛋白的85%，主要构成厚纤维以负责心脏抗拉强度；CollagenⅢ约占总胶原蛋白的11%，其直径相对较小，主要构成细纤维以维持心肌的弹性［21］。CF 是产生ECM 的主要细胞，负责ECM的动态平衡，然而在心脏损伤或应激刺激下，静止的CF 向肌成纤维细胞转化，表现出更强的增殖、迁移和收缩能力，且产生ECM 的能力显著增强［22］，ECM 过度沉积，从而导致心肌纤维化并损伤心脏功能。心肌纤维化还可导致心脏代谢需要的底物和氧气向心肌细胞的扩散距离增大，对心肌能量供需平衡产生负面影响。此外，心肌纤维化形成的瘢痕组织可因绝缘而形成折返的组织学基础，并诱发恶性心律失常，从而使心力衰竭的患者发生心脏性猝死［23-24］。本研究通过对心肌细胞HE 及Masson染色显示，达格列净可以显著抑制心肌细胞肥大、变性，改变其排列状态；抑制心肌胶原组织的增加，从而降低心肌间质纤维化程度。免疫组化染色显示，达格列净可通过抑制心肌纤维化以及心肌中CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白表达，进而抑制心肌重构，这可能是此类药物减少心力衰竭患者主要不良心血管事件的机制之一。

此外，本研究同时探讨了达格列净对心力衰竭动物模型体质量及常见血液学指标的影响，结果显示达格列净组与假手术组及心力衰竭组相比，体质量、白细胞计数、总蛋白、白蛋白、钾、钠、血糖、血浆渗透压差异无统计学意义，提示达格列净改善心力衰竭的机制可能与降低体质量、降糖、利尿等因素关系不大。心力衰竭组和达格列净组血红蛋白降低，可能由于实验动物心力衰竭后胃肠道水肿、食欲下降所致。然而，达格列净组和心力衰竭组相比，血红蛋白差异无统计学意义，提示达格列净改善心力衰竭的机制可能与纠正贫血关系不大。

综上，本研究验证了达格列净改善非糖尿病慢性心力衰竭兔心功能的作用，并发现达格列净可显著抑制心力衰竭后的心肌重构，其机制可能与抑制心肌组织中CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达和心肌纤维化有关。但因本研究技术条件所限，未能揭示达格列净对心力衰竭动物动脉血压变化的影响；此外，未对达格列净抑制心肌纤维化的分子机制行深入探讨。因此，达格列净对心肌成纤维细胞活化过程中相关细胞信号转导通路及基因表达水平的影响有待今后进一步研究。