SIRT7在胰腺癌中的表达及其与免疫浸润水平相关性分析

王首寒，武 艳，孙小单

(1.吉林省肿瘤医院腹部肿瘤外科，吉林 长春130012；2.吉林省肿瘤医院病理科，吉林 长春 130012；3.吉林省肿瘤医院博士后工作站，吉林 长春 130012)

沉默信息调节因子2同源蛋白7(silent information regulator 2 homolog protein 7，SIRT7)是哺乳动物Sirtuins家族成员之一，为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的第三类组蛋白去乙酰化酶，参与细胞代谢、应激反应、DNA损伤修复及核糖体RNA转录与修饰等重要生理过程[1]。近年来，越来越多的研究发现，SIRT7在多种人类恶性肿瘤中异常高表达[2-14]，提示其可能作为促癌基因发挥作用。相反地，在头颈部鳞癌组织中检测到SIRT7表达下调。此外，SIRT7还参与多种肿瘤的放化疗抵抗等[3,15]。目前有关SIRT7在胰腺癌中的表达及其与免疫浸润水平关系的研究较少。本研究基于生物信息数据库及临床组织验证等方法，分析SIRT7在胰腺癌中的表达及其与免疫浸润水平的相关性。

1 材料与方法

1.1Oncomine数据库与GEPIA数据库分析 Oncomine数据库(www.oncomine.org)为在线肿瘤芯片数据库[16]，用于研究分析SIRT7mRNA在胰腺癌与正常胰腺组织中的表达情况。搜索内容和阈值设置如下:①基因，SIRT7；②分析类型，Cancer vs. Normal；③数据类型，DNA and mRNA；④样品类型，Clinical Specimen；⑤数据集筛选标准，P<0.05，fold change=2，gene rank=Top 10%。将所得结果汇总后，进一步筛选“癌症类型：Pancreatic Cancer”。筛选结果以箱式图呈现。GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)是用来查询肿瘤组织与正常组织之间差异表达基因等多种信息的工具[17]。通过“Boxplot”模块分析SIRT7 mRNA在正常胰腺及胰腺癌组织中的表达。

1.2免疫组织化学染色 收集2019年1月—2020年12月吉林省肿瘤医院腹部肿瘤外科手术切除的胰腺癌组织标本27例，并收集对应的癌旁组织(距离肿瘤边缘>5 cm)作为对照。所有患者均为初治患者，术前未行其他治疗。所有标本均经由本院病理科证实。将标本固定在10%多聚甲醛中，石蜡包埋，切成4 mm切片。经烤片、二甲苯脱蜡和浓度梯度酒精脱水，柠檬酸pH 6.0高温高压抗原修复3 min，普通羊血清封闭，将切片与SIRT7兔多克隆抗体(Proteintech,武汉，稀释比例1∶100)共同孵育4 ℃过夜。次日复温30 min，DAB法(北京中杉金桥有限公司)显色1 min，苏木素复染细胞核，盐酸酒精分化，自来水流水反蓝，最后进行梯度酒精、无水乙醇、二甲苯脱水透化后封片。正置显微镜拍照。

1.3TISIDB数据库分析 TISIDB(http://cis.hku.hk/TISIDB/)是肿瘤与免疫系统交互的数据库，用于基因表达与肿瘤浸润淋巴细胞丰度相关性分析[18]。检索SIRT7基因，选择“Lymphocyte”，选择“Pancreatic adenocarcinoma”，item分别选择“效应记忆T细胞(Effector memory CD8+T cell)”、“活化B细胞(activated B cell)”、“自然杀伤细胞(natural killer cell，NK cell)”、“自然杀伤T细胞(natural killer T cell，NKT cell)”及“辅助T细胞17(type 17 helper T cell，Th17 cell)”，探讨SIRT7表达与胰腺癌免疫浸润水平的相关性。

1.4cBioPortal数据库分析 cBioPortal(http://cbioportal.org)是用于查询、分析和可视化来自多种数据库的多维癌症基因组数据的开放式网页资源[19]。选择胰腺癌相关数据集，应用Oncoprint模块分析SIRT7基因变异情况。

1.5STRING数据库分析 STRING数据库(https://string-db.org/)是一个在线预测蛋白质之间功能关联的生物数据库[20]。检索SIRT7蛋白，物种选择人类，构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络。下载生物学功能及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析结果，利用Excel软件进行汇总，可视化与SIRT7相互作用蛋白的生物学功能及所参与的通路。

1.6统计学方法 应用SPSS 24.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验,相关性采用Pearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1SIRT7mRNA在胰腺癌中的表达情况 Oncomine数据库中共有365项关于SIRT7基因的常见肿瘤类型的研究，符合筛选条件的、SIRT7表达差异显著的研究结果有32个(P<0.05)。其中有2个胰腺癌数据集提示SIRT7表达水平在癌组织中高于正常组织(图1A)。在Pei Pancreas数据集中，SIRT7 mRNA在36例胰腺癌组织中的表达水平是16例正常胰腺组织中的1.678倍(P=3.58×10-8，图1B)。在Grutzmann Pancreas数据集中，SIRT7 mRNA在11例胰腺癌组织中的表达水平是11例正常胰腺导管组织的2.004倍(P=0.033，图1B)。GEPIA数据库分析，179例胰腺癌组织中SIRT7 mRNA表达水平明显高于171例正常胰腺组织(P<0.05，图2)。

图1 Oncomine数据库中SIRT7mRNA的表达情况A.SIRT7mRNA在常见肿瘤类型中的表达(红色表示上调，蓝色表示下调)；B.SIRT7mRNA在不同数据集中的胰腺癌与正常胰腺组织的差异表达Figure 1 The expression of SIRT7 mRNA based on Oncomine database

图2 GEPIA数据库中SIRT7mRNA在胰腺癌及正常胰腺组织中的表达Figure 2 The expression of SIRT7 mRNA in pancreatic cancer and normal tissues based on GEPIA database

2.2SIRT7蛋白在临床样本中的表达情况 免疫组织化学染色结果显示，SIRT7蛋白在癌旁组织中弱表达，而在胰腺癌组织中的表达增强，呈棕黄色颗粒样，主要位于细胞浆及部分胞核(图3)。胰腺癌组织中SIRT7蛋白表达阳性率明显高于癌旁组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 SIRT7在胰腺癌及癌旁组织的表达情况Table 1 The expression of SIRT7 in pancreatic cancer and adjacent tissues (n=27,例数，%)

图3 SIRT7蛋白在胰腺癌及癌旁组织的表达(免疫组织化学 ×100)A.癌旁组织；B.胰腺癌组织Figure 3 The expression of SIRT7 protein in pancreatic cancer and adjacent normal tissues(immunohistochemistry ×100)

2.3SIRT7基因表达水平与胰腺癌免疫浸润丰度相关性 TISIDB 数据库分析结果显示：SIRT7基因表达水平与胰腺癌浸润效应记忆T细胞、活化B细胞、NK细胞及NKT细胞的表达丰度呈负相关，而与Th17细胞的表达丰度呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05)，图4。

图4 SIRT7与胰腺癌肿瘤免疫浸润水平的相关性A.SIRT7与效应记忆T细胞丰度相关性；B. SIRT7与活化B细胞丰度相关性；C. SIRT7与NK细胞丰度相关性；D. SIRT7与NKT细胞丰度相关性；E. SIRT7与辅助性T细胞17丰度相关性；Figure 4 Correlation of SIRT7 expression with immune infiltration level in pancreatic cancer图5 cBioPortal平台中SIRT7基因在胰腺癌中的变异情况Figure 5 The mutation landscape of SIRT7 in pancreatic cancer based on cBioportal

2.4SIRT7基因在胰腺癌中的变异情况 cBioPortal平台共收集了749例胰腺癌样本RNA测序数据。其中，发生SIRT7基因变异13例，总变异率为1.73%。其中扩增11例，缺失2例(图5)。结果说明，SIRT7基因在胰腺癌中的变异类型以扩增为主，但其变异率并不高。

2.5与SIRT7相互作用的蛋白网络及基因富集分析 STRING数据库构建SIRT7蛋白的PPI网络，其中有10种蛋白与SIRT7蛋白相互作用明显(P=3.74×10-8)，分别为组蛋白去乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)1/2/4/6/8/11、肿瘤蛋白P53(tumor protein P53,TP53)、叉头盒转录因子O3(forkhead box O3，FOXO3)、锚蛋白重复域52(ankyrin repeat domain 52，ANKRD52)和WD和四三肽重复序列1(WD and tetratricopeptide repeats 1，WDTC1)(图6)。基因富集分析结果发现，上述蛋白主要参与的生物学过程及通路包括细胞周期、Notch、磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(phosphatidylinositol 3 kinase-serine/threonine protein kinase,PI3K-AKT)等与胰腺癌发生发展密切相关的分子通路(图7)。

图6 与SIRT7蛋白相关的蛋白网络图Figure 6 Network map of interaction proteins with SIRT7

图7 与SIRT7相关基因的富集分析A.生物学功能富集分析；B.KEGG通路富集分析Figure 7 Enrichment analysis of SIRT7-intreacting genes

3 讨 论

SIRT7是哺乳动物Sirtuins家族七个成员之一，为第三类组蛋白去乙酰化酶[21]，具有多种催化活性，如对组蛋白H3K18发挥去乙酰化[22-23]、对组蛋白H3K122发挥去琥珀酰化[24]等作用，在RNA聚合酶的转录、核糖体合成、细胞应激与代谢、维持基因组稳定性等生理过程中发挥重要作用。上述生理过程一旦发生异常，就会造成疾病甚至肿瘤的发生。近年来大量研究发现，SIRT7在恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移及耐药过程中扮演重要角色。在肝癌中，SIRT7表达升高，且与不良预后有关，抑制SITR7表达导致细胞周期阻滞，细胞周期蛋白表达下降[3]；在非小细胞肺癌、胃癌、膀胱癌及卵巢癌细胞系中，SIRT7通过抗凋亡、激活凋亡相关通路等机制促进肿瘤细胞增殖[2,5,9,13,25]，说明SIRT7可能作为促癌基因发挥作用。此外，在前列腺癌、骨肉瘤及结直肠癌中，SIRT7不仅能够促进肿瘤的侵袭转移，还是放化疗抵抗发生的关键因子[10,14-15]。相反地，在乳腺癌肺部转移灶中发现SIRT7的低表达，且SIRT7缺失激活了转化生长因子β信号通路，增强上皮间质转化，说明SIRT7能够起到抑制肿瘤侵袭转移的作用[26]。综上所述，SIRT7能够通过多种机制在恶性肿瘤中扮演着不同的角色，但由于肿瘤的异质性、个体研究样本量不足、研究方法单一等因素，所得结论尚需进一步验证。

本研究利用Oncomine数据库发现，在365项SIRT7mRNA在常见恶性肿瘤表达情况的研究中，共有32个数据集发现其表达异常。在2个胰腺癌数据集中发现SIRT7的表达明显高于正常对照组。进一步利用GEPIA数据库及临床组织标本，分别在mRNA及蛋白水平上验证了SIRT7在胰腺癌组织中高表达，提示SIRT7可能是胰腺癌治疗的潜在靶点。除了靶向治疗，免疫疗法开启了肿瘤治疗领域的新纪元，将靶向与免疫疗法有机联合有望成为胰腺癌治疗的新策略[27]。肿瘤组织免疫浸润水平在一定程度上决定了免疫治疗的有效性，而肿瘤浸润淋巴细胞是存在于肿瘤间质中的一类异质性淋巴细胞群，以T细胞、B细胞和NK细胞为代表，能够反映肿瘤免疫浸润水平。本研究利用TISIDB数据库分析发现，SIRT7与胰腺癌浸润效应记忆T细胞、活化B细胞、NK及NKT细胞的表达丰度呈负相关，提示SIRT7的表达抑制上述免疫细胞向胰腺癌组织中浸润。此外，与肿瘤发生发展及免疫逃逸等密切相关的Th17细胞[28]的浸润丰度却与SIRT7的表达明显呈正相关。综上所述，提示SIRT7的异常表达与胰腺癌免疫浸润水平密切相关，可能是免疫疗效评估的潜在标志物。若以SIRT7为治疗靶点，理论上不仅可以抑制胰腺癌的发生发展，更有利于提高免疫治疗疗效。此外，739例胰腺癌样本的RNA测序结果发现，仅有13例发生了SIRT7基因变异，变异率较低，变异类型以扩增为主。最后，利用STRING数据库构建了SIRT7蛋白的PPI网络，主要有HDAC1/2/4/6/8/11、TP53、FOXO3等主要参与细胞周期、Notch、PI3K-AKT等肿瘤发生发展相关通路的蛋白与SIRT7蛋白具有明显相互作用，提示SIRT7可能与上述互作蛋白协同在胰腺癌中发挥其生物学作用。本研究充分运用多种综合肿瘤数据库及临床组织样本，初步证明了SIRT7在胰腺癌组织中高表达，并与肿瘤免疫浸润水平密切相关，与其相互作用的蛋白参与胰腺癌相关分子通路。SIRT7可作为胰腺癌诊断、治疗及免疫疗效评估的良好生物学标志物，具备一定应用前景。

然而，本研究仍存在一些不足。首先，本研究临床组织样本有限，仅通过免疫组织化学染色方法进行验证，未来仍需增加样本量，并结合多种实验方法进一步明确SIRT7的表达情况。其次，该蛋白在胰腺癌中突变率较低，且作用机制复杂，后续亦应结合体外细胞实验探索SIRT7对胰腺癌生物学行为的影响。此外，肿瘤是一个复杂的整体，异质性较强，其发生发展不是某个独立因子可以决定的，因此，寻找胰腺癌中能与SIRT7发挥协同或拮抗作用的分子仍是未来研究重点。此外，值得注意的是，本研究利用了多种数据库，各数据库之间样本的联系整合及连续性仍有待提高。