siRNA-KCNQ1OT1对人LECs凋亡的抑制作用及其靶向miR-199a-5p机制

鲁诚 张凤妍 张宇航 张佳娟

1新乡市第一人民医院眼科，新乡 453000；2郑州大学第一附属医院眼科，郑州 450000

白内障是严重致盲眼病，常用的治疗方法是手术治疗，寻求白内障的非手术治疗方法一直是相关研究的热点。研究显示，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)参与细胞增生、凋亡和氧化应激过程，如KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1 overlapping transcript 1，KCNQ1OT1)在过氧化氢(hydrogen peroxide，HO)诱导的人晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)中表达量升高，其可通过靶向负调控miR-214抑制LECs凋亡。微小RNA(micro RNA，miRNA)广泛参与多种疾病的发生和发展，包括白内障。miR-199a-5p在高糖诱导人LECs中表达量减少，miR-199a-5p通过负调控特异性蛋白1而抑制细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。LECs的EMT与白内障发病密切相关。如何干预HO诱导人LECs的生物学行为对于白内障的防治具有重要意义。关于KCNQ1OT1和miR-199a-5p调控作用研究鲜有报道，在线生物信息学网站Starbase预测显示，KCNQ1OT1与miR-199a-5p有互补结合位点，推测KCNQ1OT1和miR-199a-5p共同参与LECs的生物学功能，但二者间的相互作用及其能否对白内障的EMT过程产生影响尚未阐明。本研究拟探讨KCNQ1OT1和miR-199a-5p的相互作用及其对氧化应激状态下人LECs增生、凋亡的影响及可能的作用机制，以期为白内障的治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1

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1

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1

标本及细胞来源 收集2018年12月至2019年8月在新乡市第一人民医院行白内障手术的23例年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜组织，同时收集20例正常供体眼晶状体前囊膜组织。本研究方案经新乡市第一人民医院伦理委员会批准[批文号：2019(001)]，患者家属均签署知情同意书。人LECs株SRA01/04购于上海研生生化公司。本实验在郑州大学第一附属医院眼科学与视觉科学实验室进行。

1

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1

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2

主要试剂及仪器 胎牛血清、DMEM培养基(美国Hyclone公司)；HO(美国Sigma公司)；小干扰RNA-阴性对照(small interfering RNA-negative control，siR-NC)、siRNA-KCNQ1OT1、miR-NC、miR-199a-5p、抗miR-NC、抗-miR-199a-5p(广州锐博生物科技有限公司)；Lipofectamine2000试剂盒、Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒(日本Toyobo公司)；MTT试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；凋亡试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)；鼠单克隆bcl-2抗体(12381-1-AP)、鼠单克隆bax抗体(50571-2-Ig)、鼠单克隆甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(59094-1-Ig)(美国Protein Tech公司)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的兔抗羊IgG(SV0002)(武汉博士德生物工程有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒、丙二醛(malonaldehyde，MDA)试剂盒(南京建成生物研究所)；双荧光素酶活性试剂盒(美国Promega公司)。MultiskanFC Microplate Photometer酶标仪、AttuneNxT流式细胞仪、Applied Biosystems PCR仪(美国Thermo公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1

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2

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1

细胞培养 LECs(SRA01/04)解冻复苏后接种在含有质量分数10%胎牛血清、100 U/ml(商品单位)青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养液内，在37 ℃、体积分数5% CO恒温培养箱内进行培养，待细胞生长融合至85%，加入胰蛋白酶消化传代培养。取第5代细胞用于后续实验。

1

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2

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2

细胞分组及处理 取对数生长期细胞以1×10个/孔接种在96孔板中，将细胞分为空白对照组、模型对照组、siR-NC组、siR-KCNQ1OT1组、miR-NC组、miR-199a-5p组、siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组和siR-KCNQ1OT1+ anti-miR-199a-5p组。空白对照组不做任何处理；模型对照组采用100 μmol/L HO培养细胞24 h制作氧化应激损伤模型；其余各组按照Lipofectamine2000试剂盒说明分别用siR-NC、siR-KCNQ1OT1、miR-NC、miR-199a-5p、siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC、siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p转染LECs 6 h后更换培养基，添加100 μmol/L HO继续培养24 h。

1

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2

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3

实时荧光定量PCR检测晶状体前囊膜组织及各组细胞中KCNQ1OT1和miR-199a-5p表达 取晶状体前囊膜组织及各组培养的细胞，采用Trizol试剂盒抽提细胞总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA，按照荧光定量试剂盒的操作步骤进行PCR反应。引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。KCNQ1OT1正向引物序列：5'-GCACTCTGGGTCCTGTTCTC-3'，反向引物序列：5'-CACTTCCCTGCCTCCTACAC-3'；GAPDH正向引物序列：5'-ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3'，反向引物序列：5'-TTTCTAGACGGCAGGTCAGG-3'。miR199a-5p正向引物序列：5'-TTATTACCCAGGCAGACACCG-3'，反向引物序列：5'-AGTGCGAACTGTGGCGAT-3'；U6正向引物序列：5'-CTTCGGCAGCACATATAC-3'，反向引物序列：5'-GAACGCTTCACGAATTTGC-3'。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40个循环；60 ℃延长5 min。以GAPDH作为KCNQ1OT1反应的内参，U6作为miR-199a-5p反应的内参，采用2法计算KCNQ1OT1和miR-199a-5p相对表达量。

1

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2

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4

MTT法检测细胞活力 将培养的各组细胞接种在96孔板中，细胞密度为5×10个/ml，在恒温培养箱内培养48 h，每孔培养基中加入20 μl MTT，室温培养4 h，加入DMSO溶液150 μl，结晶振荡溶解，采用酶标仪在波长为490 nm处检测吸光度(

A

)值。细胞生存率(%)=(实验组

A

值-空白组

A

值)/(对照组

A

值-空白组

A

值)×100%。

1

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2

.

5

流式细胞术检测细胞凋亡率 将培养的各组细胞接种在6孔板中，细胞密度为1×10个/ml，加入磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)制备细胞悬液，取悬液200 μl，加入Annexin V-FITC和PI 5 μl，避光孵育15 min，加入PBS 150 μl重悬细胞1 h，流式细胞仪检测细胞凋亡水平。细胞凋亡率(%)=早期凋亡细胞百分率+晚期凋亡细胞百分率。

1

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2

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6

Western blot法检测细胞中bcl-2和bax蛋白表达 取各组培养细胞加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，按照BCA法定量蛋白。100 ℃变性10 min，取35 μg上样，10% SDS-PAGE处理蛋白样品，转膜，采用新鲜脱脂牛奶封闭2 h，分别加入bcl-2(1∶ 500)、bax(1∶ 500)和GAPDH抗体(1∶ 1 000)，4 ℃孵育24 h，加入HRP标记的IgG抗体(1∶ 2 500)，37 ℃孵育2 h，加入化学发光液显影并拍照，应用Band Scan 5.0凝胶软件扫描分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1

.

2

.

7

ELISA法检测各组细胞中SOD活性和MDA含量 取各组培养细胞，离心半径14 cm，1 000 r/min离心10 min，收集细胞上清液，根据SOD试剂盒说明书步骤，将上清液稀释至150 μl，酶标仪上检测589 nm处

A

值，计算细胞SOD活性。SOD活性值=(对照组

A

值-实验组

A

值)×样品体积/(0.5×对照组

A

值×样品鲜重×测定样品用量)。按照MDA试剂盒说明书步骤，将上清液稀释至10 μl，与待测样本混匀，离心取上清液，于酶标仪上检测530 nm、600 nm处

A

值，计算细胞MDA含量。MDA含量=6.45×(

A

-

A

)-0.560。

1

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2

.

8

双荧光素酶报告实验检测法验证KCNQ1OT1和miR-199a-5p的关系 生物信息学网站预测显示，KCNQ1OT1与miR-199a-5p有结合互补关系，构建KCNQ1OT1野生型载体(KCNQ1OT1-WT)和突变型载体(KCNQ1OT1-MUT)，分别与miR-NC和miR-199a-5p转染LECs(SRA01/04)48 h，采用双荧光素酶活性试剂盒检测荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析。计量资料数据经Shapiro-Wilk检验证实呈正态分布，以表达，2个组间计量资料数据比较采用独立样本

t

检验；多组间计量资料的数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-

t

检验。

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常供体和白内障患者晶状体前囊膜组织中KCNQ1OT1和miR-199a-5p表达比较

与正常供体组织相比，白内障患者晶状体前囊膜组织内KCNQ1OT1 mRNA相对表达量明显升高，差异有统计学意义(

t

=14.112，

P

<0.001)；miR-199a-5p相对表达量明显降低，差异有统计学意义(

t

=16.507，

P

<0.001)(表1)。

2.2 模型对照组与空白对照组细胞中KCNQ1OT1和miR-199a-5p相对表达量比较

与空白对照组比较，模型对照组细胞中KCNQ1OT1 mRNA相对表达量明显升高，差异有统计学意义(

t

=15.449，

P

<0.001)；miR-199a-5p相对表达量较空白对照组明显降低，差异有统计学意义(

t

=22.823，

P

<0.001)(表2)。

表1 正常供体和白内障患者晶状体前囊膜组织中KCNQ1OT1和miR-199a-5p相对表达量比较(x±s)Table 1 Comparison of the expressions of KCNQ1OT1 and miR-199a-5p in lens anterior capsule between normal donor and cataract patients (x±s)组织样本量KCNQ1OT1miR-199a-5p正常供体前囊膜200.97±0.191.04±0.15白内障患者前囊膜232.41±0.420.36±0.12t值14.11216.507P值<0.001<0.001 注:(独立样本t检验) KCNQ1OT1:KCNQ1重叠转录物1;miR:微小RNA Note:(Independent samples t test) KCNQ1OT1:KCNQ1 overlap-ping transcript 1;miR:microRNA

表2 模型对照组与空白对照组细胞中KCNQ1OT1和miR-199a-5p相对表达量比较(x±s)Table 2 Comparison of the relative expression levels of KCNQ1OT1 and miR-199a-5p between two groups (x±s)组别样本量KCNQ1OT1miR-199a-5p空白对照组91.03±0.090.97±0.08模型对照组92.35±0.240.32±0.03t值15.44922.823P值<0.001<0.001 注:(独立样本t检验) KCNQ1OT1:KCNQ1重叠转录物1;miR:微小RNA Note:(Independent samples t test) KCNQ1OT1:KCNQ1 overlap-ping transcript 1;miR:microRNA

2.3 不同siRNA转染组KCNQ1OT1及凋亡相关蛋白表达量比较

模型对照组、siR-NC组细胞中bax蛋白表达条带强于空白对照组和siR-KCNQ1OT1组，bcl-2蛋白表达条带弱于模型对照组和siR-NC组(图1)。空白对照组、模型对照组、siR-NC组、siR-KCNQ1OT1组细胞中KCNQ1OT1及bcl-2和bax蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义(

F

=96.159、175.196、85.656，均

P

<0.001)，其中与空白对照组比较，模型对照组细胞中KCNQ1OT1和bax蛋白相对表达量明显升高，bcl-2蛋白相对表达量明显降低，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)；与siR-NC组比较，siR-KCNQ1OT1组细胞中KCNQ1OT1和bax蛋白相对表达量降低，bcl-2蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)(图1，表3)。

图1 不同siRNA转染组凋亡相关蛋白表达电泳图 1：空白对照组；2：模型对照组；3：siR-NC组；4：siR-KCNQ1OT1组 bax：bcl-2相关X蛋白；bcl-2：B细胞淋巴瘤/白血病-2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶Figure 1 Electrophoretogram of apoptosis-related protein in different siRNA transfection groups 1：blank control group；2：model control group；3：siR-NC group；4：siR-KCNQ1OT1 group bax：bcl-2 related X protein；bcl-2：B-cell lymphoma/leukemia-2；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

表3 不同siRNA转染组细胞中KCNQ1OT1及凋亡相关蛋白相对表达量比较(x±s)Table 3 Comparison of the relative expressions of KCNQ1OT1 and apoptosis-related proteins among different siRNA transfection groups (x±s)组别样本量KCNQ1OT1bcl-2bax空白对照组90.98±0.060.97±0.080.92±0.07模型对照组92.21±0.22a0.41±0.03a1.76±0.16asiR-NC组92.16±0.240.44±0.041.72±0.15siR-KCNQ1OT1组91.54±0.13b0.67±0.07b1.26±0.12bF值96.159175.19685.656P值<0.001<0.001<0.001 注:与空白对照组比较,aP<0.05;与siR-NC组比较,bP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) siRNA:小干扰RNA;KCNQ1OT1:KC-NQ1重叠转录物1;NC:阴性对照;bcl-2:B细胞淋巴瘤/白血病-2;bax:bcl-2相关X蛋白 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with siR-NC group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) siRNA:small interfering RNA;KCNQ1OT1:KCNQ1 overlapping transcript 1;NC:negative control;bcl-2:B-cell lymphoma/leukemia-2;bax:bcl-2 re-lated X protein

2.4 不同siRNA转染组细胞生存率和凋亡率比较

空白对照组、模型对照组、siR-NC组、siR-KCNQ1OT1组细胞生存率和凋亡率总体比较差异均有统计学意义(

F

=136.460、137.352，均

P

<0.001)，其中与空白对照组比较，模型对照组细胞生存率明显降低，细胞凋亡率明显升高，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)；与siR-NC组比较，siR-KCNQ1OT1组细胞生存率明显升高，细胞凋亡率明显降低，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)(图2，表4)。

图2 流式细胞术检测不同siRNA转染组细胞凋亡水平 A：空白对照组 B：模型对照组 C：siR-NC组 D：siR-KCNQ1OT1组Figure 2 Cell apoptosis analysis of different siRNA transfection groups detected by flow cytometry A：blank control group B：model control group C：siR-NC group D：siR-KCNQ1OT1 group

2.5 不同siRNA转染组细胞中氧化应激相关指标比较

不同转染组细胞中SOD活性值和MDA含量总体比较差异均有统计学意义(

F

=162.758、81.059，均

P

<0.001)，其中与空白对照组相比，模型对照组SOD活性值显著降低，MDA含量显著升高，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)；与siR-NC组比较，siR-KCNQ1OT1组SOD活性值显著升高，MDA含量显著降低，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)(表5)。

2.6 KCNQ1OT1与miR-199a-5p的靶向关系

在线生物信息学预测结果显示，KCNQ1OT1与miR-199a-5p存在互补的核苷酸序列。与miR-NC组比较，miR-199a-5p组的KCNQ1OT1-WT荧光素酶活性值显著降低，差异有统计学意义(

t

=21.131，

P

<0.001)，2个组间KCNQ1OT1-MUT荧光素酶活性值比较差异无统计学意义(

t

=1.302，

P

=0.211)(图3，表6)。

表4 不同siRNA转染组细胞生存率和凋亡率比较(x±s,%)Table 4 Comparison of cell survival rate and apoptosis rate among different siRNA transfection groups (x±s,%)组别样本量细胞生存率细胞凋亡率空白对照组998.2±9.89.2±0.9模型对照组942.5±4.6a26.5±2.9asiR-NC组946.7±4.227.2±3.1siR-KCNQ1OT1组975.1±6.7b15.3±1.2bF值136.460137.352P值<0.001<0.001 注:与空白对照组比较,aP<0.05;与siR-NC组比较,bP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) siRNA:小干扰RNA;NC:阴性对照;KC-NQ1OT1:KCNQ1重叠转录物1 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with siR-NC group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) siRNA:small interfering RNA;NC:negative control;KCNQ1OT1:KCNQ1 o-verlapping transcript 1

表5 不同siRNA转染组细胞中SOD活性值和MDA含量比较(x±s)Table 5 Comparison of SOD activity and MDA concentration in cells among different siRNA transfection groups (x±s)组别样本量SOD活性值[mmol/(L·min)]MDA含量(mmol/L)空白对照组945.4±3.936.7±3.5模型对照组921.4±2.2a65.4±5.7asiR-NC组918.6±1.868.6±6.1siR-KCNQ1OT1组932.5±3.1b49.2±4.0bF值162.75881.059P值<0.001<0.001 注:与空白对照组比较,aP<0.05;与siR-NC组比较,bP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) siRNA:小干扰RNA;SOD:超氧化物歧化酶;MDA:丙二醛;NC:阴性对照;KCNQ1OT1:KCNQ1重叠转录物1 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with siR-NC group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) siRNA:small interfering RNA;SOD:superoxide dismutase;MDA:malondialde-hyde;NC:negative control;KCNQ1OT1:KCNQ1 overlapping transcript 1

图3 KCNQ1OT1与miR-199a-5p结合位点 KCNQ1OT1：KCNQ1重叠转录物1；WT：野生型；miR：微小RNA；MUT：突变型Figure 3 The binding site of KCNQ1OT1 and miR-199a-5p KCNQ1OT1：KCNQ1 overlapping transcript 1；WT：wild type；miR：microRNA；MUT：mutant type

表6 各组间野生型和突变型KCNQ1OT1荧光素酶活性值比较(x±s)Table 6 Comparison of the luciferase activity of wild-type and mutant KCNQ1OT1 between two groups (x±s)组别KCNQ1OT1-WTKCNQ1OT1-MUTmiR-NC组1.03±0.080.95±0.07miR-199a-5p组0.40±0.040.99±0.06t值21.1311.302P值<0.0010.211 注:(独立样本t检验) KCNQ1OT1:KCNQ1重叠转录物1;WT:野生型;MUT:突变型;miR:微小RNA;NC:阴性对照 Note:(Independent samples t test) KCNQ1OT1:KCNQ1 overlap-ping transcript 1;WT:wild type;MUT:mutant type;miR:microRNA;NC:negative control

2.7 不同miRNA转染组细胞miR-199a-5p及凋亡相关蛋白表达量比较

模型对照组和miR-NC组细胞中bax蛋白表达条带明显强于空白对照组，bcl-2蛋白表达条带弱于空白对照组；miR-199a-5p组细胞中bax蛋白表达条带明显弱于miR-NC组，bcl-2蛋白表达条带强于模型对照组和miR-NC对照组(图4)。空白对照组、模型对照组、miR-NC组和miR-199a-5p组miR-199a-5p及bcl-2和bax蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义(

F

=367.360、220.909、61.407，均

P

<0.001)，其中与空白对照组比较，模型对照组miR-199a-5p和bcl-2蛋白相对表达量下降，bax蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)；与miR-NC组比较，miR-199a-5p组miR-199a-5p和bcl-2蛋白相对表达量明显升高，bax蛋白相对表达量显著降低，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)(表7)。

图4 不同miRNA转染组凋亡相关蛋白表达电泳图 1：空白对照组；2：模型对照组；3：miR-NC组；4：miR-199a-5p组 bax：bcl-2相关X蛋白；bcl-2：B细胞淋巴瘤/白血病-2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶Figure 4 Electrophoretogram of apoptosis-related proteins in different miRNA transfection groups 1：blank control group；2：model control group；3：miR-NC group；4：miR-199a-5p group bax：bcl-2 related X Protein；bcl-2：B-cell lymphoma/leukemia-2；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

表7 不同miRNA转染组细胞中miR-199a-5表达及凋亡相关蛋白相对表达量比较(x±s)Table 7 Comparison of the expression of miR-199a-5 and the relative expression of apoptosis-related proteins among different miRNA transfection groups (x±s)组别样本量miR-199a-5pbcl-2bax空白对照组90.99±0.060.95±0.070.96±0.08模型对照组90.35±0.03a0.42±0.03a1.66±0.15amiR-NC组90.38±0.040.39±0.041.61±0.14miR-199a-5p组90.63±0.05b0.66±0.06b1.26±0.12bF值367.360220.90961.407P值<0.001<0.001<0.001 注:与空白对照组比较,aP<0.01;与miR-NC组比较,bP<0.01(单因素方差分析,LSD-t检验) miRNA:微小RNA;NC:阴性对照;bcl-2:B细胞淋巴瘤/白血病-2;bax:bcl-2相关X蛋白 Note:Compared with blank control group,aP<0.01;compared with miR-NC group,bP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test) miRNA:microRNA;NC:negative control;bcl-2:B-cell lymphoma/leukemia-2;bax:bcl-2 related X protein

2.8 不同miRNA转染组细胞生存率和凋亡率比较

空白对照组、模型对照组、miR-NC组和miR-199a-5p组细胞生存率和凋亡率总体比较差异均有统计学意义(

F

=184.269、370.944，均

P

<0.001)，其中与空白对照组比较，模型对照组细胞生存率明显降低，细胞凋亡率明显升高，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)；与miR-NC组比较，miR-199a-5p组细胞生存率明显升高，细胞凋亡率明显降低，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)(图5，表8)。

图5 流式细胞术检测不同miRNA转染组细胞凋亡水平 A：空白对照组 B：模型对照组 C：miR-NC组 D：miR-199a-5p组Figure 5 Cell apoptosis analysis of different miRNA transfection groups determined by flow cytometry A：blank control group B：model control group C：miR-NC group D：miR-199a-5p group

2.9 不同miRNA转染组SOD活性值和MDA含量比较

空白对照组、模型对照组、miR-NC组和miR-199a-5p组SOD活性值和MDA含量总体比较差异均有统计学意义(

F

=164.651、66.376，均

P

<0.001)，其中与空白对照组比较，模型对照组SOD活性值明显降低，MDA含量明显升高，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)；与miR-NC组比较，miR-199a-5p组SOD活性值明显升高，MDA含量明显降低，差异均有统计学意义(

P

<0.05)(表9)。

2

.

10

抑制miR-199a-5p表达后miR-199a-5p相对表达量、细胞生存率、凋亡和氧化应激相关指标比较与siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组相比，siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p组bax蛋白表达条带增强，bcl-2蛋白表达条带减弱。siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p组miR-199a-5p相对表达量、细胞生存率、bcl-2蛋白相对表达量和SOD活性值明显低于siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组，细胞凋亡率、bax蛋白相对表达量和MDA含量显著高于siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组，差异均有统计学意义(均

P

<0.05)(图6，7，表10)。

表8 不同miRNA转染组细胞生存率和凋亡率比较(x±s,%)Table 8 Comparison of cell survival rate and apoptosis rate among different miRNA transfection groups (x±s,%)组别样本量细胞生存率细胞凋亡率空白对照组999.7±8.78.7±0.6模型对照组945.4±3.9a27.1±1.9amiR-NC组941.2±4.126.4±1.7miR-199a-5p组969.5±5.8b14.2±1.1bF值184.269370.944P值<0.001<0.001 注:与空白对照组比较,aP<0.05;与miR-NC组比较,bP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验) miRNA:微小RNA;NC:阴性对照 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with miR-NC group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) miRNA:microRNA;NC:negative control

表9 不同miRNA转染组细胞中SOD活性值和MDA含量比较(x±s)Table 9 Comparison of SOD activity and MDA concentration among different miRNA transfection groups (x±s)组别样本量SOD活性值[mmol/(min·L)]MDA含量(mmol/L)空白对照组941.2±3.433.4±3.1模型对照组917.2±1.8a61.6±5.8amiR-NC组920.4±2.058.4±5.5miR-199a-5p组928.6±2.5b45.1±4.2bF值164.65166.376P值<0.001<0.001 注:与空白对照组比较,aP<0.01;与miR-NC组比较,bP<0.01(单因素方差分析,LSD-t检验) miRNA:微小RNA;SOD:超氧化物歧化酶;MDA:丙二醛;NC:阴性对照 Note:Compared with blank control group,aP<0.01;compared with miR-NC group,bP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test) miRNA:microRNA SOD:superoxide dismutase;MDA:malondialdehyde;NC:negative control

图6 抑制miR-199a-5p表达后凋亡相关蛋白表达电泳图 1：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组；2：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p组 bax：bcl-2相关X蛋白；bcl-2：B细胞淋巴瘤/白血病-2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶Figure 6 Electrophoretogram of apoptosis-related proteins after inhibiting miR-199a-5p expression 1：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC group；2：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p group bax：bcl-2 related X protein；bcl-2：B-cell lymphoma/leukemia-2；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

表10 抑制miR-199a-5p表达后各组miR-199a-5p相对表达量、细胞生存率、凋亡和氧化应激指标比较(x±s)Table 10 Comparison of relative expression level of miR-199a-5p,cell survial rate,apoptosis and oxidative stress index between two groups after inhibiting miR-199a-5p expression (x±s)组别样本量miR-199a-5p相对表达量细胞生存率(%)细胞凋亡率(%)bcl-2蛋白相对表达量bax蛋白相对表达量SOD活性值[mmol/(L·min)]MDA含量(mmol/L)siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组90.93±0.0778.2±7.214.4±1.60.72±0.071.32±0.1436.7±3.445.2±3.8siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p组90.35±0.0362.3±6.821.4±1.80.53±0.041.58±0.1625.3±2.253.2±4.7t值22.8474.8168.7207.0703.6698.4453.971P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.0010.001 注:(独立样本t检验) miR:微小RNA;KCNQ1OT1:KCNQ1重叠转录物1;NC:阴性对照;bcl-2:B细胞淋巴瘤/白血病-2;bax:bcl-2相关X蛋白;SOD:超氧化物歧化酶;MDA:丙二醛 Note: (Independent samples t test) miR:microRNA;KCNQ1OT1:KCNQ1 overlapping transcript 1;NC:negative control;bcl-2:B-cell lympho-ma/leukemia-2;bax:bcl-2 related X protein;SOD:superoxide dismutase;MDA:malondialdehyde

图7 流式细胞术检测抑制miR-199a-5p表达后细胞凋亡水平 A：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组 B：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p组Figure 7 Cell apoptosis analysis after the inhibition of miR-199a-5p detected by flow cytometry A：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC group B：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p group

3 讨论

LECs凋亡是除先天性白内障外其他类型白内障形成的细胞分子基础，减轻LECs凋亡和氧化损伤是防治白内障的关键。在体外实验中常用HO、高糖和高钙等因素诱导LECs产生大量活性氧，促进细胞氧化损伤和凋亡。本研究采用100 μmol/L HO诱导人LECs损伤后，细胞活力和SOD活性明显降低，细胞凋亡率和MDA含量显著升高，bcl-2蛋白表达下调，bax蛋白表达上调，表明HO诱导的人LECs损伤模型构建成功。

LncRNA已被证实在白内障疾病中发挥着关键作用，如肺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)在高糖诱导的人LECs中表达上调，MALAT1通过激活p38MAPK信号通路促进高糖诱导人LECs凋亡和氧化应激，并抑制细胞增生。Du等研究结果显示，INK4基因座中反义非编码RNA(antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL)在HO诱导的人LECs中表达上调，ANRIL通过靶向负调控miR-21促进HO诱导的人LECs凋亡。KCNQ1OT1位于人染色体11p15.5，在多种疾病中表达上调，如KCNQ1OT1在白内障组织和转化生长因子β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)诱导的人LECs中表达上调，沉默KCNQ1OT1通过调节miR-29c-3p/FOS轴促进TGF-β2诱导的人LECs增生和转移，并抑制细胞凋亡。本研究发现HO诱导人LECs损伤后KCNQ1OT1表达上调，抑制KCNQ1OT1能够增强细胞活力和SOD活性，降低细胞凋亡率和MDA含量，上调bcl-2蛋白表达，下调bax蛋白表达，表明抑制KCNQ1OT1可以增强LECs活力，减缓细胞凋亡和氧化应激，这与之前的研究结果相似。有研究发现，miR-199a-5p在高糖诱导人LECs中表达下调，miR-199a-5p通过SP1调控细胞的EMT过程，但是对HO诱导的人LECs研究机制尚不明确。在线生物信息学网站预测结果显示，KCNQ1OT1和miR-199a-5p有互补的结合位点，并进行首次验证。

miRNA已经成为近年在白内障研究中的热点，如miR-34a、miR-124和miR-204等已被证实与白内障相关。Zhou等研究显示，miR-23b-3p在白内障组织和HO诱导的人LECs中表达上调，miRNA-23b-3p通过靶向负调控SIRT1抑制HO诱导的人LECs凋亡和自噬，这与本研究结果相反。Li等研究显示，miR-182-5p在HO诱导的人LECs中表达下调，而过表达miR-182-5p可增强LECs增生活性，并抑制细胞凋亡和氧化损伤。以上研究说明miRNA与白内障发展有关，但是miR-199a-5p与白内障的研究鲜有报道。本研究结果显示，miR-199a-5p在HO诱导人LECs中表达下调，过表达miR-199a-5p可以增强细胞活力和SOD活性，细胞凋亡率和MDA含量降低，上调bcl-2蛋白表达，下调bax蛋白表达。KCNQ1OT1可通过调控下游多个miRNA影响疾病的发生和发展，通过在线生物信息学网站预测显示，miR-199a-5p是KCNQ1OT1的靶标，双荧光素酶报告实验证实KCNQ1OT1可以靶向miR-199a-5p的表达。进一步研究发现，抑制miR-199a-5p表达可部分恢复抑制KCNQ1OT1对HO诱导的人LECs增生、凋亡和氧化应激的影响，说明KCNQ1OT1通过靶向负调控miR-199a-5p的表达减弱HO诱导人LECs损伤。

综上所述，本研究结果显示在HO诱导的人LECs氧化应激损伤中KCNQ1OT1表达上调，miR-199a-5p表达下调，siRNA-KCNQ1OT1通过上调miR-199a-5p的表达增强人LECs的活力，并抑制细胞凋亡和氧化应激。关于miR-199a-5p对下游基因的调控作用以及KCNQ1OT1与miR-199a-5p对信号转导途径的作用机制需要进一步研究。

利益冲突

所有作者均声明不存在任何利益冲突

作者贡献声明

鲁诚：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、起草及修改文章；张凤妍：酝酿和设计实验、实施研究、对文章知识性内容的审阅和智力性内容的修改及定稿；张宇航：采集数据、分析/解释数据、起草文章；张佳娟：采集数据