过表达miR-122-5p通过靶向调控NOD2对帕金森病模型细胞损伤的保护作用及其机制

王倩 王罗俊 顾然 田甜 李亚骐 瞿祥 龙光文 涂丽 蔡立君 田锦勇

(1贵州省人民医院神经内科，贵州 贵阳 550002；2中国人民解放军空军军医大学附属西京医院神经内科；3贵州省人民医院急诊内科；贵州医科大学附属医院 4全科医学科；5神经内科)

帕金森病(PD)高发于老年人群，其临床表现为运动迟缓、姿势平衡障碍等，目前关于多巴胺神经元细胞凋亡的机制尚未完全阐明〔1〕。因而如何抑制神经元细胞凋亡成为治疗PD的关键环节。研究表明颅脑损伤后微小RNA-122-5p(miR-122-5p)的表达下调，其可能通过促使p53表达上调而促进神经细胞凋亡〔2〕。miR-122在大鼠肝损伤中呈低表达，上调miR-122对肝细胞化学性损伤发挥保护作用〔3〕。但miR-122-5p在PD模型细胞损伤中的作用机制尚未完全阐明。Targetscan预测miR-122-5p的靶基因，预测显示核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)2可能是miR-122-5p的靶基因，研究表明NOD2在6-羟基多巴胺(OHDA)诱导的PD动物模型中呈高表达，敲除NOD2可减轻神经元损伤〔4〕。肾缺血再灌注损伤小鼠肾组织中NOD2表达水平升高，抑制NOD2信号通路可减轻炎症反应而减轻肾损伤〔5〕。NOD2高表达还可促进溃疡性结肠炎的发生及发展，抑制NOD2表达可减轻结肠黏膜炎症〔6〕。脑缺血后脑组织中NOD2的表达上调，下调NOD2的表达可对局灶性脑缺血发挥保护作用〔7〕。但miR-122-5p是否通过调控NOD2的表达影响PD细胞的损伤尚未可知。因此本研究主要探讨miR-122-5p是否通过调控NOD2基因而抑制MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 SH-SY5Y细胞购自美国ATCC细胞库。1-甲基-4苯基-吡啶离子(MPP+)购自美国Sigma公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司；胰蛋白酶购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司；Trizol、逆转录及实时荧光定量(qRT)PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；RIPA蛋白裂解液购自美国Sigma公司；Lipofectamine2000购自北京索莱宝科技有限公司；miR-122-5p mimics、miR-122-5p抑制剂(anti-miR-122-5p)、NOD2小干扰RNA(si-NOD2)及其各自阴性对照购自广州锐博生物科技公司；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒均购自南京建成生物工程；二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自北京碧云天生物有限公司；NOD2、Bax、Bcl-2抗体与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗均购自美国Santa Cruz公司。

1.2实验分组 用1 mmol/L的MPP+诱导SH-SY5Y细胞建立PD模型(MPP+组)，未经处理的SH-SY5Y细胞作为Con组〔8〕，将SH-SY5Y细胞随机分为： MPP++miR-NC组(miR-NC转染SH-SY5Y细胞48 h，随后用1 mmol/L的MPP+处理24 h)、MPP++miR-122-5p组(miR-122-5p mimics转染SH-SY5Y细胞48 h，随后用1 mmol/L的MPP+处理24 h)、MPP++si-NC组(si-NC转染SH-SY5Y细胞48 h，随后用1 mmol/L的MPP+处理24 h)、MPP++si-NOD2组(si-NOD2转染SH-SY5Y细胞48 h，随后用1 mmol/L的MPP+处理24 h)、MPP++miR-122-5p+pcDNA组(miR-122-5p mimics与空载体pcDNA共转染SH-SY5Y细胞48 h，随后用1 mmol/L的MPP+处理24 h)、MPP++miR-122-5p+pcDNA-NOD2组(miR-122-5p mimics与pcDNA-NOD2共转染SH-SY5Y细胞48 h，随后用1 mmol/L的MPP+处理24 h)。

1.3qRT-PCR检测细胞中miR-122-5p、NOD2 mRNA表达水平 收集各组细胞，加入1 ml Trizol，细胞裂解后转移至1.5 ml无菌无酶的EP管内，室温放置10 min，加入200 μl氯仿，振荡混匀，室温孵育5 min，4℃ 12 000 r/min转速离心15 min，吸取上清转移至另一无菌无酶的EP管内，加入200 μl异丙醇，室温静置10 min，4℃ 12 000 r/min转速离心10 min，弃上清，加入预冷乙醇，反复冲洗后晾干，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解沉淀，应用紫外分光光度计测定RNA质量。参照反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，配制qRT-PCR体系：SYBR Green 预混液15 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O补足体系至25 μl。反应条件：95℃预变性2 min，变性、退火及延伸：40个循环(95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)。miR-122-5p以U6为内参，NOD2 以GAPDH为内参，置于96孔板荧光定量PCR仪进行扩增反应，反应结束后得到Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miR-122-5p、NOD2 mRNA相对表达量。

1.4测定MDA、GSH含量 收集各组细胞，采用比色法检测MDA、GSH含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 分别取各组转染后SH-SY5Y细胞，按照细胞凋亡检测试剂盒进行操作，预冷PBS洗涤细胞，取1×106个细胞加入200 μl结合缓冲液重悬，加入5 μl Annexin V-FITC与5 μl的PI，充分混匀，室温避光孵育15 min，加入400 μl结合缓冲液重悬至流式管内，应用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6双荧光素酶报告基因实验 SH-SY5Y细胞以每孔3×103个细胞的密度接种于96孔板，常规培养12 h，按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书，每孔共转NOD2的3'-非翻译区(UTR)荧光素酶报告基因(40 ng)或其突变载体、pRL-TK荧光素酶内参质粒(10 ng)及终浓度为20 nmol/L的miR-122-5p mimics，以miR-NC为对照，转染24 h，应用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。

1.7Western印迹检测NOD2、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达 SH-SY5Y细胞处理后分别收集各组细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，采用BCA法测定蛋白浓度，取30 μg蛋白样品进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用含有牛血清白蛋白(BSA)的Tis-HCl缓冲液(TBST)封闭1 h，加入NOD2、Bax、Bcl-2抗体(1∶500)，4℃孵育24 h，TBST洗膜，加入二抗(1∶2 000)，室温杜宇1 h，TBST洗膜，滴加ECL显影，应用ImageJ软件分析条带灰度值。

1.8统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验，方差分析。

2 结 果

2.1miR-122-5p和NOD2在MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤中的表达 与Con组相比，MPP+组SH-SY5Y细胞中miR-122-5p表达水平显著降低，NOD2 mRNA及蛋白表达水平显著升高(均P<0.001)，见表1、图1。

2.2miR-122-5p靶向调控NOD2的表达 Targetscan预测miR-122-5p的靶基因，miR-122-5p可靶向NOD2的3'UTR区，见图2。为验证miR-122-5p是否靶向作用于NOD2，构建NOD2的荧光报告基因载体及突变体载体后，共转染NOD2的3'UTR荧光素酶报告基因载体与miR-122-5p mimics，结果显示，miR-122-5p可抑制NOD2的3'UTR荧光素酶报告基因的活性(P<0.05)，而当miR-122-5p的结合位点突变后，miR-122-5p对NOD2的3'UTR荧光素酶报告基因活性的抑制作用消失，见表2。

表1 miR-122-5p和NOD2在MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤中的表达

图1 Western印迹检测NOD2蛋白

图2 NOD2的3'UTR中含有与miR-122-5p互补的核苷酸序列

表2 双荧光素酶报告实验

采用Western印迹检测结果显示，SH-SY5Y细胞中转染miR-122-5p mimics后，与miR-NC组(0.43±0.04)相比，miR-122-5p组NOD2蛋白表达水平显著降低(0.22±0.02，P<0.05)；而SH-SY5Y细胞中转染anti-miR-122-5p后，与anti-miR-NC组(0.41±0.05)相比，anti-miR-122-5p组NOD2蛋白表达水平显著升高(0.89±0.08，P<0.05)，见图3。

1～4：miR-NC组，miR-122-5p组，anti-miR-NC组，anti-miR-122-5p组图3 miR-122-5p靶向调控NOD2的表达

2.3miR-122-5p过表达对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响 与Con组比较，MPP+组SH-SY5Y细胞中MDA含量明显升高，而GSH含量明显降低，细胞凋亡率显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)，进一步研究显示，与MPP++miR-NC组相比，MPP++miR-122-5p组SH-SY5Y细胞中MDA含量明显降低，GSH含量明显升高，细胞凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白表达水平显著升高，Bax蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)，见表3、图4、图5。

2.4抑制NOD2表达对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响 与MPP++si-NC组比较，MPP++si-NOD2组SH-SY5Y细胞中MDA含量明显降低，GSH含量明显升高，细胞凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白表达水平显著升高，Bax蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)，见图6、表4。

表3 miR-122-5p过表达对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响

图4 miR-122-5p过表达对MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响

1～4:Con组,MPP+组，MPP++miR-NC组，MPP++miR-122-5p组图5 Western印迹检测凋亡相关蛋白表达

1～4：Con组，MPP+组，MPP++si-NC组，MPP++si-NOD2组图6 NOD2和凋亡相关蛋白表达

表4 抑制NOD2表达对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响

2.5NOD2过表达逆转了miR-122-5p过表达对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用 与MPP++miR-122-5p+pcDNA组比较，MPP++miR-122-5p+pcDNA-NOD2组SH-SY5Y细胞NOD2蛋白表达、凋亡率、MDA含量与Bax蛋白表达水平均显著升高，而GSH含量及Bcl-2蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05)，见表5、图7。

表5 NOD2过表达逆转了miR-122-5p过表达对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用

1～4：miR-NC组，miR-122-5p组，miR-122-5p+pcDNA组，miR-122-5p+pcDNA-NOD2组图7 NOD2和凋亡相关蛋白表达

3 讨 论

miRNA可通过结合mRNA的3'UTR区序列而负性调控基因表达进而参与神经退行性疾病等多种病理过程〔9,10〕。研究表明炎症因子释放量增加可损伤多巴胺神经元，既往研究发现PD发病机制与多巴胺氧化产生的毒性代谢物、细胞凋亡及炎症反应等密切相关〔11〕。

miR-122-5p在黑色素瘤组织中高表达，并可通过诱导细胞周期阻滞而抑制细胞增殖〔12〕。miR-122-5p在不同病理类型或不同组织中的表达及其可能作用机制不同，研究表明miR-122-5p在四氯化碳诱导的急性肝损伤大鼠中表达下调，上调miR-122-5p表达可有效改善大鼠肝脏损伤〔13〕。miR-122-5p在膝骨关节炎中的表达水平降低，其低表达量与疾病严重程度呈负相关〔14〕。本研究结果说明miR-122-5p表达降低可能加重MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤。GSH属于抗氧化酶类并可有效降低氧化应激反应从而防止脂质过氧化引起的神经元凋亡〔15〕。PD疾病发生过程中Bcl-2与Bax可介导神经元细胞凋亡、细胞质性细胞死亡等过程，研究表明Bcl-2过表达或Bax低表达可减少神经元细胞的凋亡〔16〕。说明PD模型细胞中的氧化应激反应被激活，抗氧化应激能力降低，神经元细胞凋亡增加，而miR-122-5p过表达可明显提高细胞抗氧化能力及抗凋亡能力。提示miR-122-5p过表达可改善MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤，对SH-SY5Y细胞发挥保护作用。

本研究结果证实NOD2是miR-122-5p的靶基因，miR-122-5p可负性调控NOD2表达，其中NOD2属于NOD家族成员，并可在多种炎症性疾病或免疫疾病中发挥重要作用，研究表明NOD2在PD发生过程中可能发挥重要作用〔17〕。NOD2可通过调控多种信号通路参与炎症反应、氧化应激反应等多种病理过程，研究表明敲除NOD2基因可通过减少炎症因子生成量而改善糖尿病小鼠肾损伤〔18〕。相关研究报道指出，敲除NOD2基因可通过减少TNF-α等炎性细胞因子释放及促进Bcl-2蛋白表达而保护PD小鼠神经元〔19〕。提示miR-122-5p可能通过调控NOD2基因表达而保护PD模型细胞。进一步研究发现，抑制NOD2表达后，MPP+诱导SH-SY5Y细胞氧化应激水平降低，细胞凋亡能力受到抑制，而NOD2过表达可逆转miR-122-5p过表达对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。提示miR-122-5p过表达可靶向抑制NOD2表达及增强抗氧化能力从而对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤发挥保护作用。

综上所述，MPP+诱导SH-SY5Y细胞模型中，miR-122-5p表达下调，NOD2表达上调，miR-122-5p过表达可通过靶向NOD2抑制细胞凋亡及增强其抗氧化能力，对PD模型细胞损伤发挥保护作用，可为PD治疗提供新方向。