单因素实验法优化韭菜籽中皂苷提取工艺

沈 婧

（苏州市产品质量监督检验院，江苏苏州 215000）

我国的韭菜籽储备十分充足，作为行气理血、温补肾阳的食材，用于食疗入药已有超过千年的传统历史。而迄今为止，民间笃信的韭菜籽滋补肝肾、抗疲劳功能还未有过真实可靠的书面报道，其药效或药理研究也是寥寥无几[1]。高效分离出韭菜籽中有效成分对于今后研究者或是药物研发单位都有着十分重要的意义[2]。本研究利用分光比色法探究优化韭菜籽中皂苷的提取工艺，提纯出韭菜籽中抗疲劳成分，为发挥其功能性物质成分的作用奠定基础[3]。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

RE52CS 旋转蒸发器，上海亚荣生化；HH-2 数显恒温水浴锅，金坛市荣化；WFJ UV-2000 紫外可见分光光度计，尤尼柯；EL204 电子分析天平，上海梅特勒-托利多。

1.2 材料与试剂

95%工业酒精；无水乙醇、冰醋酸、高氯酸和香草醛，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 韭菜籽中皂苷提取工艺

目前国内从中草药中提取活性成分的工艺主要有溶剂萃取法、沉淀法、盐析法、透析法等。桑圣明等[4]用溶剂萃取法从韭菜籽中分离确认出生物碱、皂苷类以及酰胺类化合物。溶剂萃取法中溶剂的挑选，要满足对目标物溶解度大、对非目标物溶解度小的要求，依据这一点性质将目标物从中草药中溶解出来[5]。粉碎好的中草药泡在选好的溶剂中时，通过扩散作用，溶剂分子透过细胞壁渗入草药组织细胞内，溶解目标物，使得细胞内目标物浓度大于细胞外，构成了浓度差，于是细胞内高浓度溶液不断透过细胞壁向细胞外扩散，同时细胞外的低浓度溶剂又渗入组织细胞内。本研究选用酒精作为溶剂提取韭菜籽中的皂苷，并用分光比色法测定总皂苷的含量。

1.3.2 提取工艺的单因素实验探究

用破壁机将干燥的韭菜籽打成韭菜籽粉末，过4号筛，备用。

（1）酒精浓度单因素实验。准备6 个150 mL 干净的具塞玻璃锥形瓶，准确称取6 份0.2 g（精确到小数点后4 位）的韭菜籽粉末于锥形瓶中。用量筒量取50 mL 的纯净水以及30%vol、40%vol、50%vol、55%vol 和60%vol 的酒精溶液，分别加入6 个锥形瓶中，摇匀。在20 ℃恒温水浴中回流1 h，静置后取上层清液过滤，重复提取3 次，将收集到的滤液采用分光比色法测定总皂苷的含量，计算皂苷提取率。

（2）料液比单因素实验。准备4 个干净的150 mL和2个500 mL具塞玻璃锥形瓶，准确称取6份0.2 g（精确到小数点后4 位）的韭菜籽粉末于锥形瓶中。分别用移液枪和量筒准确量取12.5 mL（1∶62.5 g∶mL）、25.0 mL（1 ∶125 g ∶mL）、50.0 mL（1 ∶250 g ∶mL）、100.0 mL（1∶500 g∶mL）、200.0 mL（1∶1 000 g∶mL）和400 mL（1 ∶2 000 g ∶mL）的50%vol 酒精溶液，分别加入6 个锥形瓶中，摇匀。在20 ℃恒温水浴中回流1 h，静置后取上层清液过滤，重复提取3 次，将收集到的滤液采用分光比色法测定总皂苷的含量，计算皂苷提取率。

（3）提取温度单因素实验。准备6 个干净的150 mL 具塞玻璃锥形瓶，准确称取6 份0.2 g（精确到小数点后4 位）的韭菜籽粉末于锥形瓶中。分别用量筒量取50 mL 的60%vol 酒精溶液加入锥形瓶，摇匀。分别控制在恒温水浴温度为20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃的条件下回流1 h，静置后取上清液过滤，重复提取3 次，取收集到的滤液采用分光比色法测定总皂苷的含量，计算皂苷提取率。

（4）提取时间单因素实验。准备6 个干净的150 mL 具塞玻璃锥形瓶，准确称取6 份0.2 g（精确到小数点后4 位）的韭菜籽粉末于锥形瓶中。用量筒准确加入50 mL 的60%vol 酒精溶液，分别在恒温60 ℃水浴的条件下回流1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 和6 h，静置后取上清液过滤，重复提取3 次，取滤液采用分光比色法测定总皂苷的含量，计算皂苷提取率。

1.3.3 分光比色法测定总皂苷的含量

（1）对照品溶液的制备。取对照品10 mg，用甲醇定容至10 mL，充分混匀使之溶解，得到对照品溶液，其浓度10 mg/mL。

（2）韭菜籽提取液的制备。将韭菜籽放入破壁机打碎后过筛得到韭菜籽粉末，精密称量韭菜籽粉末0.200 0 g 置于锥形瓶中。用量筒量取50 mL 一定度数的乙醇溶液加入锥形瓶中进行提取，充分振荡锥形瓶，提取后过滤出滤液待测。

（3）测定波长的选择。用合适量程范围的移液枪分别准确移取1.5 mL 对照品溶液、1 mL 韭菜籽预先粗提取液于干净磨口锥形瓶中，真空旋转蒸发溶液至近干的状态。迅速用移液枪准确向锥形瓶中加入0.8 mL 的高氯酸、0.2 mL 的5%香草醛-冰醋酸（不可用久置试剂，现用现配），使瓶内物质完全溶解，皆置于60 ℃水浴中进行显色反应15 min，而后用流动水快速冷却旋蒸瓶。加入5 mL 冰醋酸摇晃均匀，立即（防止冰醋酸挥发产生较大误差）在400 ～800 nm 波长下扫描紫外分光光度，记录数据与曲线图。如图1、图2 所示，对照品（即纯品）跑出吸光度曲线中的高峰（标记2），与韭菜籽粗提取液跑出吸光度曲线中的高峰（标记2）是在同一波长区域的位置，则能够确定两个位置的物质为同一物质——皂苷。由此可以得到分光比色法测定韭菜籽中皂苷的波长为454 nm，为后续测定做准备。

图1 200 ～1 000 nm 韭菜籽纯品中皂苷的吸光度曲线

图2 200 ～1 000 nm 韭菜籽提取液中皂苷的吸光度曲线

（4）标准曲线绘制。用移液枪分别准确吸取对照品溶液（1 mg/mL）0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.25 mL、0.35 mL、0.45 mL 和0.55 mL，于干净的25 mL 圆底烧瓶中。70 ℃真空旋转蒸发至近干，迅速用移液枪准确加入0.8 mL 的高氯酸，0.2 mL 的5%香草醛-冰醋酸，同时作一空白样，皆置于60 ℃水浴显色15 min 后，用流动水迅速冷却烧瓶。加入5 mL 冰醋酸摇晃均匀，立即在454 nm 下测定吸光度，记录数据，绘制标准曲线。

（5）样品皂苷含量测定。用移液枪精密移取2 mL韭菜籽提取液于干净磨口锥形瓶中，按（4）中步骤测定吸光度，以标准曲线方程计算样品中皂苷的含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制结果

由1.3.3（4）中测得数据绘制标准曲线如图3 所示。韭菜籽中皂苷含量的标准曲线方程为y=1.840 5x-0.007 7，R2=0.993 4。

图3 皂苷标准曲线图

2.2 单因素实验结果

2.2.1 不同酒精浓度对韭菜籽中皂苷提取率的影响

在整个提取工艺中，提取剂的支出成本占总成本的比重较大，考虑到节约成本是企业获利的一个重要方面，就要最大限度地发挥提取液的提取效果。传统工艺中，草本中药中的提取物多为简单可取的资源，例如用酒精或者水作为溶剂来提取，选择合适的酒精提取液浓度也可以合理有效地减少提取的成本。由图4 可知，当使用50%vol 酒精时，韭菜籽中皂苷的提取效果最佳，因此选取50%vol 的酒精是最为合理的。

图4 不同酒精浓度对韭菜籽中皂苷提取率的影响

2.2.2 不同料液比对韭菜籽中皂苷提取率的影响

料液比越大，则意味着细胞内的液体浓度与细胞外溶剂之间的浓度差越大，活性物质分子的扩散速率也就越快，渗透作用加速。由图5 可知，料液比从1 ∶62.5 到1 ∶1 000，随着溶剂体积量的增大，提取率会也随之递增。但超过1 ∶1 000 后的提取率出现异常下降，其中原因不得而知，考虑到提取后的浓缩经济成本及复杂的技术、不确定因素等，并且在料液比在1 ∶125 ～1 ∶250 皂苷提取率趋近于平稳状态，故选取料液比为1 ∶250。

图5 不同料液比对韭菜籽中皂苷提取率的影响

2.2.3 不同提取温度对韭菜籽中皂苷提取率的影响

由图6 知，一定范围内，皂苷的提取率随着温度的升高而不断提升。物质溶解于溶剂中时会吸收溶剂中的热量，当物质内的温度升高，根据化学平衡移动原理，反应条件改变，系统内的平衡会向有利于吸热的方向移动。提取温度升高到70 ℃后，系统内就会产生一些化学反应变化，导致提取率降低。因此，提取温度定为60 ℃最为合适。

图6 不同提取温度对韭菜籽中皂苷提取率的影响

2.2.4 不同提取时间对韭菜籽中皂苷提取率的影响

由图7 可知，提取时间越长，提取率越高，因此在工业化生产中的提取时间有待进一步比对确定。皂苷的提取率在2 ～4 h 达到一定的稳定状态，则实验室中的最佳提取时间可选用3 h 左右。

图7 不同提取时间对韭菜籽中皂苷提取率的影响

2.3 工艺条件验证

综合本次单因素实验结果，皂苷提取的实验室最优条件为50%vol 酒精、温度60 ℃、料液比1 ∶250、提取时间3 h。取6 组该条件下提取出的平行样品，测得韭菜籽总皂苷含量的均值为4.63%（表1）。

表1 含量测定结果表

3 结论

韭菜籽中有效物质的分离、纯化对于韭菜籽药理作用的研究有十分重要的意义，补肾抗疲劳产品具有很大的市场应用前景。本研究采用单因素实验法对提取工艺条件进行优化，得到韭菜籽中提取皂苷的最优条件为50%vol 酒精作为溶剂提取液、料液比1 ∶250（体积比）、60 ℃恒定温度回流、提取时间设定在3 h 左右，提取3 次。由于实验室设备等的限制，在实际生产中分离、过滤等方面提取条件应该根据具体的设备条件进行适当调整。