雪糕中的菌落总数测量不确定度评定

刘 畅，赵新宇

（1.鞍山市检验检测认证中心-食药所，辽宁鞍山 114021；2.辉山乳业（沈阳）销售有限公司研发部，辽宁沈阳 110121）

冷冻饮品是人们在夏日里消暑解渴的首选，然而冷冻饮品的生产工艺环节较多，且产品裸露在空气中时间较长，生产过程中很容易受到微生物污染[1-2]。在食品安全评价中，菌落总数作为食品检测中最常见的卫生指标，通常用于表明细菌污染的程度[3]。但由于微生物的特殊性，其在样品中的分布并不均匀，所以检测结果会存在较大的分散性。不确定度是指由于存在不可避免的误差，对被测量值不能肯定的程度。不确定度越小，测量值与被测量的真实值越接近[4]。为了保证检测的准确性，本文将依据菌落总数测定标准对市售某品牌的同一批次雪糕进行菌落总数的检测，并采用bottom-up 方法与食品微生物测量不确定度评估指南对检测结果进行不确定度评定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售某品牌雪糕；平板计数琼脂，北京陆桥技术股份有限公司；0.85%生理盐水，北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

百级洁净室；FZ-20001 电子天平，上海凡展衡器有限公司；YXQ-LS-100S Ⅱ蒸汽压力灭菌器，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；HH-4 恒温水浴锅，常州普天仪器制造有限公司；SPX-250F-Ⅱ生化培养箱，上海龙跃仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

用灭菌镊子除去包装纸，将冰棍/雪糕部分放入无菌均质袋中，木棒留在袋外，捏紧袋口，用力抽出木棒，置45 ℃水浴15 min，溶化后立即进行检验[5]。

1.3.2 检测过程

以无菌吸管吸取25 mL 样品置于225 mL 生理盐水均质袋中，充分混匀，制成1 ∶10 的样品匀液；用1 mL 无菌吸管吸取样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注入9 mL 生理盐水试管中，振摇试管混合均匀，制成1 ∶100 的样品匀液，倍比稀释；分别吸取1 mL 样品匀液于两个无菌平皿内，及时将约20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀；待琼脂凝固后，翻转平板于（36±1）℃培养48 h。

1.3.3 菌落总数计数

如果只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再乘以相应的稀释倍数，作为每mL 样品中菌落总数结果；如果有两个连续稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，按式（1）进行计算[6]。

式中：N为样品中菌落数，CFU/mL；ΣC为平板菌落数之和，CFU/mL；n1为第一稀释度平板个数；n2为第二稀释度平板个数；d为稀释因子。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源

本实验以市售某品牌同一批次的10 个雪糕为样品，固定设备，培养基、试剂同一批次，单人两次开展检测，每个样品做3 个稀释度，每个稀释度做2个平行，最终得到20 个检测结果。由于无菌室的洁净度、培养基的质量、培养箱的温度波动以及检测人员的操作水平等分量的不确定度不能依靠直接测量或统计学的方式进行评定，因此本实验仅考虑次级取样、倍比稀释、倾注平皿和再现性检测结果所带来的不确定度因素。

2.2 不确定度分量

根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）中规定，样品制备中使用的量筒和分度吸管等玻璃量具均有相应的最大允差，见表1[6-7]。

表1 玻璃量具的最大允差

2.2.1 次级取样引入的不确定度

以无菌吸管吸取25 mL 样品置于225 mL 生理盐水均质袋中，充分混匀，制成1 ∶10 的样品匀液；次级取样过程中使用的玻璃量具为A 级25 mL分度吸管和量出式250 mL 量筒，由表1 可知，A 级25 mL 分度吸管引入的标准不确定度为：

吸取25 mL 样品引入的相对标准不确定度为：

量出式250 mL 引入的标准不确定度为：

量取225 mL 生理盐水引入的相对标准不确定度为：

则次级取样引入的相对标准不确定度为：

2.2.2 倍比稀释引入的不确定度

用1 mL 无菌吸管吸取样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注入9 mL 生理盐水试管中，振摇试管混合均匀，制成1 ∶100 的样品匀液，倍比稀释；此过程使用的玻璃量器为A 级1 mL 分度吸管和A 级10 mL 分度吸管，同2.1.1。

A 级1 mL 分度吸管引入的标准不确定度为：

吸取1 mL 样品稀释液引入的相对标准不确定度为：

A 级10 mL 分度吸管引入的标准不确定度为：

吸取9 mL 生理盐水引入的相对标准不确定度为：

本实验每个样品做3 个稀释度，因此倍比稀释2 次，则倍比稀释引入的相对标准不确定度

2.2.3 倾注平皿引入的不确定度

分别吸取1 mL 样品匀液于两个无菌平皿内，及时将约20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀；本实验不考虑培养基的体积和温度所引入的不确定度，所以此过程的不确定度仅为A 级1 mL 分度吸管所引入，3 个稀释度，每个稀释度做2 个平行，共引入6 次，则倾注平皿引入的不确定度为

2.2.4 再现性检测引入的不确定度

通过不同时间的两次实验（以A 和B 表示），对10 个样品的检测结果见表2，依照标准，先将检测结果的单位从CFU/mL 转换为lg(CFU/mL)，再计算再现性标准差SR。

表2 再现性检测引入的不确定度

2.3 合成标准不确定度

2.4 扩展不确定度U

在 包 含 因 子 为2（ 置 信 水 平95%）时，U=2uc(y)=0.094 lg(CFU/mL)。

2.5 结果报告

本次雪糕中的菌落总数检测结果平均值为8 600 CFU/mL，对数形式表示为2.9 lg(CFU/mL)；按照食品微生物学测量不确定度评估指南，本次测量不确定度结果是8.6×103CFU/mL[6.4×102，9.8×102]，以对数形式表示为（2.9±0.094）lg(CFU/mL)。

3 结论

食品中微生物检测由于自然污染物的不规律分布及动态变化特点，造成同一批次的独立样品间检测结果差异显著。本次检测未能引入的分量，在日常检测中应考虑到其对检测结果的影响。如无菌室的洁净度、商品化即用型培养基、检测使用的设备及实验人员的技术水平等。只有时刻保持细致严谨的工作态度，才能完成上述所有质量控制工作，进而对不同基质的多个检测项目进行不确定度的评定。