樟树籽油抗氧化能力及物质基础研究

李 雪， 张 玉， 王君虹， 孙素玲， 王 伟,朱申龙， 沈国新， 牛二利

(浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所1，杭州 310021) (农业农村部农产品信息溯源重点实验2，杭州 310021) (浙江省农业科学院木本油料品质营养国际联合实验室3，杭州 310021)

植物油氧化是指其在加工、储藏过程中与氧气进行的反应。油脂氧化反应产物—过氧化物分解可形成具有异味的酸败产物，导致油的感官风味变差；同时，油脂酸败会破坏油中的营养组分，使油的营养品质降低；而有些氧化产物具有致癌性，食用后会诱发机体的生理异常，危害人体健康[1,2]。因此，油脂氧化是影响植物油质量安全的主要因素。氧化应激普遍存在于生物体内，活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是导致氧化应激的主要因素，ROS是细胞内氧化还原稳态信号调节分子，当其水平超过正常范围时，体内氧化还原稳态被打破，使靶组织和敏感细胞损伤，进而导致多种疾病的发生、发展[3]。植物油中的天然抗氧化物可保持油脂的感官和营养品质并延长其货架期，还对保护人体防御氧化应激损伤具有重要作用[4]。因此，抗氧化活性是评价植物油品质的重要指标之一[5]。植物油的抗氧化活性影响因素较多，研究表明脂肪酸组成及微量组分多酚、不皂化物等与植物油的抗氧化能力密切相关[6,7]，其中微量组分的作用受到广泛关注。

樟树属于樟科樟属，常绿高大乔木植物，广泛分布于我国长江流域及长江以南地区，资源十分丰富。樟树单棵樟树籽年产量可达50 kg以上，但长期以来樟树籽基本处于“自生自灭”状态，开发利用极少，造成了资源浪费和环境污染[8]。因此，樟树籽的开发利用具有极大的现实意义。据报道，樟树籽含油量达到37%以上，其油脂中含有多种脂肪酸，主要为癸酸和月桂酸，相对质量分数在90%以上[9]。樟树籽油溶点低、皂化值高，属于不干性油，无毒副作用，可用作化妆品的乳化剂、均质剂、防冻剂，食品中的乳化剂、稳定剂和润湿剂等[10]。另外，樟树籽油还是生产生物柴油的好原料[11]。樟树籽油不仅可用于工业上，还具有抑菌[12]、快速补充能量[13]、显著减少体内脂肪蓄积的作用[14]，对肥胖导致的代谢紊乱、菌群失调、动脉硬化等均具有改善作用，其中，抗氧化活性在樟树籽油改善代谢紊乱的机制中发挥重要作用[15-17]。由此，樟树籽油在食品及医药领域具有广阔的开发前景。樟树籽油活性物质基础的研究相对薄弱，目前研究主要集中在樟树籽油的脂肪酸组成及加工工艺上[8,9]，对于微量化合物及其对樟树籽油活性的贡献率研究较少，这制约了樟树籽油的进一步开发与利用。因此，本研究以樟树籽油为实验对象，对其理化参数、化合物组成(脂肪酸、不皂化物、总多酚)及抗氧化活性进行分析，初步明确抗氧化活性物质基础，为樟树籽油的开发利用及提高樟树资源的利用率提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

樟树籽油、初榨橄榄油。

37种脂肪酸甲酯标样(纯度>99%)，没食子酸标准品(纯度>99%)，苯并[α]芘标准品(纯度>99%)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)，福林酚试剂、氢氧化钾，酚酞、异辛烷、冰醋酸、碘化钾、硫代硫酸钠、淀粉、环己烷、正庚烷、无水乙醇、甲醇、碳酸钠均为分析纯。甲苯、乙腈、正己烷、二氯甲烷、乙醚为色谱纯。超纯水(电阻率18.2 mΩ·cm-1)。苯并[α]芘分子印迹柱(500 mg，6 mL)。

1.2 仪器设备

Trace 3100气相色谱仪配备氢火焰离子化检测器，AMR-100全自动酶标分析仪，Waters e2695高效液相色谱仪，RV10-D-V型旋转蒸发器。

1.3 实验方法

1.3.1 樟树籽油理化指标检测

樟树籽油过氧化值及酸值的测定分别依照国标方法GB 5009.227—2016及GB 5009.229—2016[18-19]。苯并[α]芘测定参照GB 5009.27—2016[20]。色泽、透明度测定参照GB/T 5525—2008[21]。

1.3.2 脂肪酸组成分析

脂肪酸甲酯化依据国际油橄榄协会(IOC)COI/T.20/Doc. No 33[22]标准方法。

气相色谱条件：HP-88毛细管柱 (30 m×0.25 mm×0.2 μm i.d., Agilent)。升温程序：70 ℃保持1 min, 以 10 ℃/min升至120 ℃保持1.5 min，以3 ℃/min升至230 ℃保持2 min，分流进样，分流比1∶50。进样量0.5 μL，检测器及进样口温度为270 ℃，载气为氮气，流速2 mL/min-1。

1.3.3 总多酚分析

樟树籽油中总多酚的检测参照文献方法[23]，采用液液萃取法进行多酚类化合物的提取，采用福林酚比色法在750 nm波长处测定样品吸光度，以没食子酸作为标准溶液制作工作曲线，计算样品中总多酚含量。

1.3.4 不皂化物分析

樟树籽油不皂化物的制备参考文献方法[24]，并稍作修改：准确称取5 g樟树籽油，加入50 mL 2 mol/L的氢氧化钾乙醇溶液，80 ℃水浴回流1 h。停止加热后于冷凝管顶部加入50 mL蒸馏水，旋转摇动。冷却后，回流液转移至分液漏斗中，加入100 mL乙醚萃取不皂化物，重复萃取1次，合并2次萃取液，并转移至分液漏斗中。在萃取液中加入40 mL水进行洗涤，收集上层液体，重复洗涤2次，回收上层提取液，低温减压蒸干溶剂，残渣在(103±2) ℃烘箱中干燥15 min。准确称量残渣质量，计算不皂化物含量，备用。

1.3.5 DPPH自由基清除能力测定

参照文献[23]报道的方法，稍加改动：吸取样品待测液100 μL，加入0.4 mmol/L DPPH溶液100 μL，摇匀，室温反应30 min，应用全自动酶标仪测定520 nm波长处的吸光度(A样品)；样品待测液100 μL与无水乙醇100 μL混合，在520 nm处测定吸光度(A对照)；测定100 μL DPPH溶液与100 μL无水乙醇的混合液在520 nm波长处的吸光度(A空白)。DPPH清除率按以下公式计算：

1.3.6 数据处理

数据采用3次重复实验的平均值和相对标准偏差(RSD)表示。采用GraphPad prism (ver. 5, GraphPad Software®, USA)进行抗氧化活性的IC50值计算，利用Microsoft Excel 2007软件进行数据统计及显著性分析，P<0.05被认为是显著的，P<0.01被认为是极显著。

2 结果与分析

2.1 樟树籽油的理化性质

樟树籽油的理化参数测定结果见表1。樟树籽油在常温下为液态，颜色呈淡黄色，色泽澄清透明，具有樟树特有的芳香气味，无异味。油脂酸值为(2.4±0.0)mg/g，显著高于文献报道值(0.168～0.178mg/g)[9, 25]，表明游离脂肪酸含量较高，可能是榨油原料的质量问题导致其酸值偏高；油脂过氧化值为(0.16±0.01) mmol/kg，显著低于文献中测定数据(1.665 mmol/kg-1)，说明樟树籽油过氧化物含量少，油脂氧化程度低[15]；以上指标符合国家食用植物油标准(GB 2716—2018)[26]。樟树籽油苯并[α]芘含量为(6.00±0.21) μg/kg，低于国家食品中污染物限量标准(GB 2762—2017)中油脂及其制品中苯并[α]芘的限量要求[27]。

表1 樟树籽油的理化性质与微量化合物含量

2.2 樟树籽油的脂肪酸组成

樟树籽油的脂肪酸通过与标准物质保留时间比对进行定性分析，按照峰面积归一化法进行定量，结果见表2。

表2 樟树籽油脂肪酸组成及含量

从樟树籽油中共鉴定出14种脂肪酸，包括4种中链脂肪酸：辛酸、癸酸、十一碳酸及月桂酸，含量高达94.80%；10种长链脂肪酸：主要为豆蔻酸、棕榈酸、油酸及亚油酸等，质量分数为5.20%，长链脂肪酸中还包括少量的ω-3脂肪酸(α-亚麻酸、二十碳五烯酸)及ω-6脂肪酸(亚油酸、γ-亚麻酸)，质量分数分别为0.08%和0.59%。与前人关于樟树籽油脂肪酸组成的分析结果相比[9, 13, 25]，本研究检测到十一碳酸、棕榈油酸、γ-亚麻酸、二十碳烯酸和二十碳五烯酸等5种脂肪酸，不同提取方法对油中脂肪酸组成影响较小，但对其相对含量有较大的影响。据报道，高含量的中链脂肪酸与樟树籽油改善肥胖、调节机体代谢紊乱的作用密切相关[15,16]。亚油酸及亚麻酸等不饱和脂肪酸具有多种生理功能，包括降低心血管疾病发病率和死亡率等[28]。

2.3 樟树籽油的微量化合物含量分析

樟树籽油中总多酚含量为(33.07±0.63)mg/kg(表1)，与国内橄榄油中总多酚含量相当(21.26～26.04 mg/kg)[29]。目前，对山茶油和橄榄油等木本油料中多酚类化合物的研究已有较多报道[30-32]，但对樟树籽油中多酚组分的研究极少。多酚类化合物是植物油中重要的化学组成部分，其数量繁多、结构多样，与植物油的独特风味密切相关，作为活性极强的天然抗氧化剂多酚化合物可增强油脂的氧化稳定性、延长油脂的货架期[33]。此外，研究表明多酚化合物具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、改善心脑血管疾病的作用[33]。鉴于多酚化合物在植物油营养品质保持及功能活性发挥方面具有重要作用，开展樟树籽油中多酚化合物的研究对于其开发利用具有重要意义。

樟树籽油中不皂化物为(0.55±0.01)%，远高于文献报道的樟树籽油中不皂化物含量[(0.32±0.04)g/kg][15],油提取方法的不同可能是导致不皂化物含量差异的主要原因。有研究对不同植物油(橄榄油、元宝枫油、美藤果油、亚麻籽油、长柄扁桃油、核桃油)的不皂化物含量进行分析，不同种类油的不皂化物差异不显著，在0.73%～0.98%之间，樟树籽油的不皂化物含量略低于其他植物油。不皂化物是植物油微量组分中的重要成分，其主要由脂肪醇、甾醇、三萜烯二醇、生育酚及角鲨烯等化合物组成，功能活性研究表明不皂化物具有抗炎及改善氧化应激的作用，并可通过调节T细胞的活性及肠道归巢能力促进炎症性肠病的治疗[24, 34]。目前，关于樟树籽油中不皂化物的活性研究鲜见报道。

2.4 樟树籽油的抗氧化能力及活性化合物分析

抗氧化活性是评价植物油品质的重要指标之一。DPPH是一种稳定的氮中心自由基，在溶液中显紫色，抗氧化物质通过单电子转移降低自由基含量，紫色消失[35]。因其操作简单、快速，DPPH自由基清除方法被广泛用于化合物体外抗氧化活性的研究。本实验采用DPPH自由基清除法对樟树籽油的抗氧化能力进行测定，并以橄榄油作为对照。结果表明，樟树籽油浓度为0.39 g/mL时，对DPPH自由基的清除率为(92.69±1.92)%，相同浓度的橄榄油的DPPH清除率为(96.23±0.26)%，樟树籽籽油对DPPH具有较高的清除率，但其清除能力略低于橄榄油。如图1所示，樟树籽油对DPPH的清除率与其浓度呈正相关性,通过清除率拟合曲线，其清除率的IC50值为0.13 g/mL。

图1 樟树籽油对DPPH自由基抑制率

针对樟树籽油抗氧化活性物质不明的问题，本研究分别对樟树籽油中的多酚组分及不皂化物的DPPH清除率进行测定。结果表明，当相同樟树籽油浓度作为基准的条件下(0.50 g/mL)，樟树籽油的DPPH清除率为(98.92±1.58)%，多酚组分的DPPH清除率为(49.60±3.78)%，不皂化物对DPPH清除率为(38.49±0.66)%，多酚类化合物的DPPH清除活性显著高于不皂化物，多酚化合物和不皂化物对樟树籽油DPPH清除能力的贡献率分别为50.14%和38.90%，二者的贡献率之和为89.04%，由此可见，樟树籽油清除DPPH自由基的活性组分主要为多酚类化合物及不皂化物。

3 结论

本实验研究了樟树籽油抗氧化活性，测定了其抗氧化活性组分，樟树籽油中多酚组分和不皂化物具有较好的DPPH自由基清除能力，二者对樟树籽油DPPH自由基清除能力的总贡献率高达89.04%，但针对樟树籽油中多酚化合物及不皂化物的组成及其与樟树籽油抗氧化活性的关系有待进一步研究。