猪流行性腹泻病毒S2 基因B 细胞表位的筛选及其单克隆抗体的制备与鉴定

孟 克，白伟琴，卡楚拉，乌志勇，苗 苗，格日勒图

（1.伊金霍洛旗动物疫病预防控制中心，内蒙古 伊金霍洛旗 017200；2.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特010018）

猪 流 行 性 腹 泻 （porcine epidemic diarrhea，PED） 是由冠状病毒猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的高度接触性肠道传染病［1］。 该病最早发现于欧洲，后期扩散至养猪业发达的亚洲东部地区， 造成的危害比原发地欧洲严重［2］。 PEDV 能感染各个年龄段的猪，被感染猪会出现呕吐、腹泻、脱水、厌食等症状，引起哺乳仔猪近100%的死亡率，给世界各国的养猪产业造成严重的经济损失［3］。 控制PEDV 有效方法是疫苗接种［4］。 PEDV 的spike（S）蛋白是一种Ⅰ型膜糖蛋白，由1 383～1 386 个氨基酸（aa）组成［5］。根据与其他冠状病毒S 蛋白的同源性，S 蛋白可分为S1（1～735aa）和S2（736～1 383aa）结构域［6］。 与其他冠状病毒S 蛋白一样，PEDV 的S 蛋白在介导病毒进入宿主体内并诱导产生中和抗体时［7］，能与细胞受体相互作用。 2011 年以来， 传统的PEDV 减毒疫苗对新出现的PEDV 毒株的血清抗体滴度通常较低， 表明经典PEDV 毒株疫苗只能对部分毒株产生交叉免疫［8］，不能诱导特异性IgA抗体产生黏膜免疫［9］。 该试验旨在利用软件分析PEDV S2 基因B 细胞表位，并通过免疫小鼠、细胞融合等方法制备单克隆抗体， 为表位肽疫苗研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 多肽抗原、细胞株

多肽抗原的合成及耦联载体钥孔血蓝蛋白（KLH）由吉尔（上海）生化有限公司完成；小鼠骨髓瘤细胞（Sp2/0）由吉尔生化（上海）有限公司抗体部提供。

1.1.2 主要试剂

RPMI1640 培养基、 胎牛血清 （FBS） 购自GIBCO 公司； 辣根过氧化物酶标记驴抗鼠IgG 购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.1.3 实验动物

5 只6 周龄的雌性BALB/c 小鼠，由上海第一人民医院（松江）动物实验中心提供。

1.2 试验方法

1.2.1 PEDV S2 基因B 细胞表位的筛选

利用CLC Sequence viewer 6.8 软件和数据库IEDB［http：//www.iedb.org/］，参考PEDV 国内外分离株，筛选出PEDV S2 基因的保守序列。 结合在线数据库IEDB 分析出能够与主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子结合的B 细胞表位，委托吉尔生化（上海） 有限公司进行多肽抗原的合成与KLH 的耦联。

1.2.2 动物免疫及抗体效价测定

选取5 只6 周龄健康的雌性BALB/c 小鼠（分别标记A、B、C、D、E），筛选的表位合成后耦联钥孔血蓝蛋白（KLH）以100 μg/只免疫BALB/c 小鼠，第1 次免疫后每隔2 周以50 μg/只免疫1 次，共进行5 次免疫。 第5 次免疫1 周后取小鼠血清，用ELISA 方法检测血清的抗体效价，分别以未接受免疫的小鼠血清和抗体稀释液作为阴性对照和空白对照。 选取抗体效价最高的小鼠加强免疫1 次。

1.2.3 杂交瘤细胞的建立

细胞融合前2 周内将Sp2/0 细胞进行复苏，置于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中进行传代培养。用含有8-氮鸟嘌呤的培养基连续处理3 次，筛选出对HAT 培养基更敏感的Sp2/0 细胞， 用于细胞融合的Sp2/0 细胞在融合前1 天进行1 次传代，可使融合当天的Sp2/0 细胞处于对数生长期。 细胞融合当天， 取8～10 周龄健康的BALB/c 小鼠腹腔巨噬细胞，调整细胞浓度至1×105～5×105个/mL，以100 μL/孔加入96 孔细胞培养板进行培养。 无菌操作摘取加强免疫小鼠的脾脏， 制备脾细胞悬液进行计数。 混匀的Sp2/0 细胞和脾细胞悬液经聚乙二醇进行细胞融合，随后转入96 孔细胞培养板，置于细胞培养箱中培养。细胞融合后需要观察杂交瘤细胞的生长，当细胞长到孔底1/4～1/3 的时候取细胞培养物上清液进行ELISA 检测。 以未免疫小鼠血清作为阴性对照，用抗体稀释液作为空白对照，试验组OD450nm值（P）与阴性对照组OD450nm值（N）的比值大于2.1（P/N≥2.1）作为阳性判断标准。采用有限稀释法选择克隆数少、OD450nm值高的阳性孔进行1～2 次的克隆化培养， 直到所有克隆化培养的细胞孔阳性率达到100%，即可获得分泌特异单克隆抗体的细胞株。

1.2.4 杂交瘤细胞的培养及保存

经克隆化培养的细胞孔阳性率达到100%时，将细胞从96 孔培养板转入24 孔培养板，再由24孔培养板转至细胞培养瓶进行扩大培养。 经扩大培养的杂交瘤细胞一部分以腹腔注射的方式免疫小鼠，使其体内产生腹水，一部分采用液氮冻存备用。

1.2.5 抗体效价测定

用ELISA 方法测定被免疫小鼠腹水及单克隆细胞株培养物上清液的抗体效价。 以2 的倍数将腹水和细胞培养物上清液进行梯度稀释，分别以未接受免疫的小鼠血清和稀释液作为阴性对照和空白对照，抗体效价为P/N≥2.1 的最大稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 表位筛选结果

应用CLC Sequence viewer 6.8 软件筛选出PEDV S2 基因的若干条保守序列，再通过IEDB 数据库筛选出能与MHCⅡ类分子结合的B 细胞表位，筛选得到的表位基因序列为5′-ATGCAATATGTT（C）TATACACCTACCTACTACATGCTT-3′，国内外分离株的区别为1 处碱基T 和C 的置换（见图1A），但是翻译后的肽段序列相同，表位肽序列为MQYVYTPTYYML（见图1B）。 保守序列的选择可以有效避免流行毒株在传播过程中产生基因变异。 结合IEDB 数据库筛选出的能与MHCⅡ类分子结合的表位，结果也能筛选出与图1B 中对应的MQYVYTPTYYML 肽段（见图1 C），由于MHCⅡ-Ag 更容易向辅助T 细胞呈递抗原， 筛选能与MHCⅡ类分子结合的表位更有希望触发细胞和体液免疫兼备的免疫应答。

2.2 融合前抗体效价的检测

应用ELISA 方法测定第5 次免疫后1 周的小鼠血清抗体效价，结果显示5 只小鼠中E 小鼠的血清抗体效价相比其他4 只小鼠较高， 约为1∶2 000（见图2），因此，取E 小鼠进行1 次加强免疫，并于3 d 后摘取脾脏进行细胞融合。

图2 细胞融合前血清抗体效价（k=1 000）

2.3 单克隆细胞株的筛选

进行细胞融合后， 取6 组杂交瘤细胞株培养物上清液经ELISA 方法测定OD450nm值。 结果显示，6 组细胞株中E-6 细胞株培养物上清液检测值最高，达到0.526（见表1）。

表1 细胞培养物上清液OD450 nm 值

2.4 腹水抗体效价的检测

腹腔注射单克隆细胞株后收集腹水用Protein G 纯化抗体。 ELISA 结果显示，腹水抗体效价约为1∶4 000（见表2）。

表2 单克隆抗体杂交瘤细胞（E-6 株）腹水效价

2.5 细胞培养物上清液抗体效价的检测

细胞培养物上清液经ELISA 方法测定， 结果显示细胞上清液抗体效价达到1∶4 000 （见表3），与腹水抗体效价相同。

表3 单克隆抗体杂交瘤细胞（E-6 株）培养物上清液抗体效价

3 讨论

PED 是威胁全球养猪业健康发展的重大疫病之一，给养猪业带来了巨大的威胁。 PEDV 感染能力极强，主要传播途径为消化道和呼吸道［10］，该病主要多发于新生仔猪造成重大损失。 新生仔猪由于免疫系统还未发育完善， 通过免疫母猪经初乳获得被动免疫力［11］。近年来，国内外研究者做了大量关于PEDV 疫苗的研究工作， 研制了不同种类的疫苗， 但是免疫保护效果不甚理想［12］， 因为PEDV 流行毒株在传播过程中出现基因变异［13］，以及制备的疫苗抗原触发的免疫应答特异性不强、中和抗体效率不佳。 PEDV 通常编码4 个结构蛋白，分别为核蛋白（N）、膜蛋白（M）、糖蛋白（S）、小膜蛋白（sM）［14］，S 糖蛋白分子量最大。 目前，确定的多个抗原表位和中和表位多位于S1 蛋白区域，其结构与功能方面的研究最为深入［15］。已有的研究主要针对PEDV S 蛋白S1 区域的功能，而对PEDV S 蛋白S2 区域的抗原性等功能研究较少［16］。 该研究应用CLC Sequence Viewer 6.8 软件分析若干个国内外流行株的PEDV S2 基因保守肽段的同时， 利用IEDB 数据库比对出与MHCⅡ类分子结合的肽段MQYVYTPTYYML 作为制备单克隆抗体的靶位肽序列， 虽然选定的MQYVYTPTYYML 肽序列经软件分析免疫原性不高，但是选定与MHCⅡ类分子有效匹配的肽序列尤为重要，因为MHCⅡ-Ag 容易向辅助T 细胞呈递抗原， 从而有望触发细胞和体液免疫兼备的免疫应答。 在该试验中， 人工合成的表位肽纯度为97.18%， 通过载体耦联后免疫小鼠的抗体效价最高值可达到1:2 000，OD450nm值为0.309，虽然表现出了有限的抗原性， 但是能够满足制备单克隆抗体的需求。 取免疫小鼠脾脏制备脾细胞悬液进行瘤细胞融合，并制备单克隆抗体，在小鼠腹水和杂交瘤细胞培养物上清液中检测到的抗体效价能达到1∶4 000，可以满足检测工作的要求。 备选多肽MQYVYTPTYYML 有限抗原性的原因之一是表位肽本身表位构象特征不够强， 其二是与载体钥孔血蓝蛋白耦联后其表位构象也受到一定影响，可解决方案为在其他靶基因序列上寻找理想的表位肽序列， 或作为载体蛋白， 筛选能够提高免疫原性、具有佐剂活性的蛋白（如细菌S-层蛋白等）。

4 结论

通过生物学软件和在线数据库成功筛选出了PEDV S2 基因B 细胞表位：MQYVYTPTYYML，经单克隆抗体制备技术成功制备B 细胞表位单克隆抗体，抗体效价达到1∶4 000，为今后表位肽疫苗的探索性研究提供了基础数据。