双歧杆菌制剂对终末期肾病患者肠道菌群和微炎症状态的影响*

张颜 张文 张燕芳 周静

(云南省第三人民医院1.肾病科；2.消化内科，云南 昆明 650118)

终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)是各种原发性或继发性肾脏疾病的终末阶段[1]。在我国，该病患病率增长迅速[2]，ESRD已成为令人瞩目的公共卫生问题。微炎症状态是ESRD患者肾功能持续恶化的主力军，当前ESRD的治疗主要依靠肾脏代替疗法，虽然透析能一定程度上减轻患者微炎症状态，延长寿命，但不能从根本上治疗肾脏病、完全代替肾脏的多种功能[3-4]，ESRD患者并不理想的预后迫使研究人员的眼光不断向新的方向展望。人体肠道中生存着庞大的菌群，影响着机体多种生理活动和许多疾病的发生发展[5]，其中许多机制并未完全明晰。近年来，不少研究表明益生菌制剂可降低慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD)患者炎性因子水平和尿毒症因子，延缓了疾病进程[6-7]。但亦有学者认为益生菌治疗既不能改善包括ESRD的CKD患者肾功能，也不能降低尿酸、尿素、血肌酐及炎症因子水平[8]，益生菌对ESRD患者的作用还需更多研究证实。双歧杆菌制剂是临床中最常用的益生菌之一，本研究旨在探索双歧杆菌乳杆菌三联活菌片对ESRD患者微炎症状态和肠道菌群的作用影响，为开辟治疗新突破口提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年2月～2021年2月我院收治的180例ESRD患者作研究对象。根据就诊顺序奇偶数将奇数者纳入观察组，偶数者纳入对照组，每组90例。纳入标准：①患者符合ESRD诊断标准[9]。②年龄>18岁。③自愿参与试验。④接受血液透析治疗，透析时间>3个月，预计生存期>1年。⑤患者及家属知情并签署知情同意书。排除标准：①酗酒、免疫性疾病、胃肠道手术史、慢性感染、炎症性肠病、恶性肿瘤等影响肠道菌群者。②近期应用抑酸剂、益生菌、抗生素、免疫抑制剂等药物。③不规律治疗者。本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.2 治疗方案 两组均积极治疗原发病，控制血压、蛋白尿、血糖，纠正水电解质紊乱，限制蛋白摄入等。观察组在此基础上，口服双歧杆菌乳杆菌三联活菌片(国药准字S19980004，内蒙古双奇药业股份有限公司，0.5 g/片)，3片/次，3次/d。

1.3 方法

1.3.1 观察指标 比较两组治疗前和治疗后3个月的血浆生化指标[血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、β2微球蛋白(β2-MG)、尿酸、甲状旁腺激素(PTH)、血胱抑素C(Cys-C)]和炎症因子[超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)]水平，以及粪便菌群丰富度、多样性和组成。

1.3.2 粪便样本采集 采集患者新鲜粪便5 g置于无菌冷冻试管中，1 h内送检，保存于-80℃冰箱中。

1.3.3 肠道菌群基因组DNA提取 应用德国产Qiagen DNA提取试剂盒对粪便样本进行总DNA提取，操作遵说明书，经过微生物细胞破碎、DNA抽提、纯化提取出微生物DNA。

1.3.4 文库构建 提取粪便微生物总DNA后，根据保守区设计引物，引物末端添加测序接头，行PCR扩增，再进行纯化、定量、均一化建立测序文库。应用Qubit和Agilent 2100行文库质检，对合格的文库用Illumina Hiseq 2500平台进行高通量测序。

1.3.5 16S rDNA高通量测序 在Hiseq上进行簇生成和测序，对DNA样本行16S rDNA V3V4区基因扩增与测序，扩增引物序列为5′-GTGTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′和5′-CCGGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′。

1.3.6 数据分析 测序所得原始数据经过质量控制测序接头序列、低质量序列、低复杂度序列，应用重叠关系进行序列拼接。去除嵌合体序列，应用Usearch 10.0软件在97%相似度下进行聚类分析，得到操作分类单元(OTU)。在Greengene数据库基础上对OTU代表序列行比对和物种注释，获取物种分类信息。根据OTU结果，对样品微生物行α多样性分析，得到样品菌群丰富度和多样性，前者通过Chao1指数和ACE指数反映，后者通过Shannon指数和Simpson指数反映。Chao1指数和ACE指数：可估计微生物物种OTU数目，二者数值越大，说明该物种OTU越多；Simpson指数：可定量描述一个区域的生物多样性，指数越大，说明群落多样性越高；Shannon指数：可估算样本中微生物多样性，指数越大说明群落多样性越高。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 随访至2021年5月31号，观察组和对照组分别有3例和5例失访，最终分别纳入87例和85例，两组年龄、性别、原发病及合并症及透析龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组治疗前后血浆生化指标比较 治疗后，观察组血浆BUN、SCr、β2-MG、尿酸、PTH、Cys-C水平与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组血浆上述指标与治疗前比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 两组治疗前后血浆生化指标比较

2.3 两组治疗前后微炎症状态比较 治疗后，观察组IL-6和TNF-α水平低于对照组，IL-10水平高于对照组(均P<0.05)，两组其余指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后，观察组IL-6和TNF-α水平低于治疗前，IL-10水平高于治疗前(均P<0.05)，两组治疗后其余指标与治疗前比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 两组治疗前后微炎症状态比较

2.4 两组治疗前后肠道菌群丰富度和多样性比较 治疗前，两组Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后，观察组Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数均高于治疗前，且高于对照组治疗后(均P<0.05)；对照组治疗前后Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，表4。

表4 两组治疗前后肠道菌群丰富度和多样性比较

2.5 观察组治疗前后肠道菌群组成比较 16S rDNA测序结果显示，观察组治疗前肠道菌群中拟杆菌属(Bacteroides)、链球菌属(Streptococcus)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、厌氧菌属(Anaerotruncus)、梭杆菌门(Fusobacteria)为主要优势，而治疗后观察组以双歧杆菌属(Bifidobacterium)、普氏菌科(Prevotellaceae)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、粪杆菌属(Feacalibacterium)、副拟杆菌属(Parabacteroides)为主要优势，见图1。

图1 两组粪便菌群LDA值分布柱状图

3 讨论

人体肠道中遍布着百亿个微生物，它们的丰富度、组成和多样性都影响着机体的代谢、免疫和消化吸收功能[10-11]，在机体罹患急慢性疾病时可发生不同程度的变化[12]。相关研究报道ESRD患者不论是否接受透析治疗，都存在肠道菌群失调，导致致病菌增多、有害代谢产物蓄积，加速了肾脏疾病病程[13]。Briskey等[14]观察到补充益生菌不仅能减少尿毒症毒素，还能减轻全身微炎症状态，为ESRD患者健康助力。本研究基于此点，探讨双歧杆菌制剂对ESRD患者肠道菌群和炎症因子水平的影响，为ESRD患者行益生菌治疗的有效性增添佐证。

韩文贝等[15]报道双歧杆菌可从多种途径改善CKD患者肾功能。本研究中，治疗后观察组血浆BUN、SCr、β2-MG、尿酸、PTH、Cys-C水平与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。表明双歧杆菌制剂对ESRD患者肾功能等生化指标水平无明显影响效果，这可能与ESRD患者病情较重以及不同研究纳入标准不一有关，类似的结论在Shariaty等[16]学者研究中亦有报道。

ESRD患者普遍存在肠道菌群紊乱[17]。本研究结果显示，治疗后，观察组Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数均高于对照组，观察组以双歧杆菌属、普氏菌科、乳酸杆菌属为主要优势。Alpha多样性分析是评估微生物多样性的常用方法，Chao1指数和ACE指数常用于描述菌群丰度，Shannon指数和Simpson指数常用于评价菌群多样性。ESRD患者由于消化道功能减退和抗生素频繁使用等原因造成菌群多样性降低、益生菌菌群占比减少。而在本研究中，应用双歧杆菌制剂的ESRD患者肠道菌群组成发生改变，菌群丰富度和多样性提高，这可能是由于益生菌菌群的增多所致。益生菌的增多能改变肠道微生态环境，限制致病菌繁殖，继而减少致病菌产生的能激活肠黏膜免疫系统的肠源性尿毒素[18]。同时，双歧杆菌制剂中的双歧杆菌参与组成抑制致病菌易位的肠黏膜生物屏障[19]，乳酸杆菌能降低血清中胺类、硫酸吲哚酚、甲酚等尿毒症毒素水平，进而减轻微炎症状态[20]，这些功能一定程度上能助力患者健康。

微炎症状态与ESRD患者发生心血管事件、认知功能障碍、脑血管并发症等不良临床结局相关，是患者病死率升高的重要原因之一[21]。IL-6和TNF-α水平能有效反映微炎症状态[22-23]，而IL-10是反向调节炎症反应的细胞因子，可抑制前两者的作用。本研究中，治疗后观察组IL-6和TNF-α水平低于对照组，IL-10水平高于对照组。双歧杆菌制剂能调节ESRD患者炎性因子水平，减轻微炎症状态，这可能是由于益生菌的细胞功能和产物影响着机体多条代谢通路[14]，间接影响了免疫系统的功能。ESRD患者肠道中有益细菌减少，有害菌群的增多改变了肠道黏膜功能、促进致病菌易位，同时还导致肠源性尿毒素增多，进一步加剧微炎症状态、损伤残余肾功能[24-26]。而双歧杆菌制剂能提升肠道有益菌含量，缓解微炎症，阻碍了肾功能减退和肠道菌群紊乱之间的恶性循环。金晓倩[27]报道在接受血液透析治疗的ESRD患者中，双歧杆菌、粪杆菌、乳杆菌与血清IL-6和TNF-α水平呈负相关。该结果支持了本文结论，但该试验研究方法与本文不同，本研究未探索不同菌种与炎性因子的相关性，这也是后续进一步的研究方向。

4 结论

双歧杆菌乳杆菌三联活菌片能改善ESRD患者的肠道微生态环境，减轻微炎症状态，未来可能成为延缓CKD进展的新兴着手方向。但本研究存在不足之处，未探讨双歧杆菌乳杆菌三联活菌片对ESRD患者微炎症状态作用的具体机制，后期有待进一步扩大样本并丰富研究内容。