银杏叶提取物生产废弃液中蛋白质的纯化工艺研究

谭琪明，李 俊，何 珺

(1.铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300；2.贵州大学，贵州 贵阳 550025；3.贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 550025)

银杏为银杏科银杏属植物。银杏是裸子植物类，是目前地球上唯一能幸存下来的银杏科银杏属植物，又称为“活化石”[1]。银杏分布地广泛，在中国、朝鲜、韩国、日本、加拿大、澳大利亚、新西兰、法国、美国、俄罗斯等国家和地区均有种植。从地理资源分布来看，中国是世界上银杏的主产区，主产于贵州、四川、湖南、河北、江苏、山东、广西、湖北、河南、浙江等省区。中国的银杏跨越北纬2l°30′～41°46′，东经97°～125°，遍及22个省及自治区和3个直辖市，主要分布于温带和亚热带气候区[2]。银杏既是国家一级保护植物，也是我国传统重要的经济林和绿化树种。中国的银杏资源占全世界的85%，银杏种植面积约40万m2，栽培数量达25亿株以上，银杏种植每年都以2 000～2 500万株速度递增[3]。银杏叶是银杏的干燥叶子，目前相当多资料表明，银杏叶具有敛肺、活血化瘀、止痛等功效，对冠心病、咳喘病、高脂血症、心绞痛等疾病有一定的治疗作用[4-5]。其最为主要的化学成分有黄酮类、萜内酯类、有机酸、多糖类等[6]。目前，已知银杏提取物的化学成分有200多种，其中药用成分有170余种，主要有黄酮类、萜内酯类、有机酸类、糖类、醇类、酮类、生物碱类、氨基酸微量元素及其他(维生素、叶绿体、生物碱类等)[7]。银杏叶提取物及其制剂可用于健康食品、医药、化妆品及生物农药和生物饲料[8]，但银杏叶提取物在生产过程中会产生大量废弃液，而这些废弃液都直接废弃掉。

本研究对银杏叶提取物生产过程中产生的废弃液中蛋白质成分进行综合回收利用，从废弃液中分离制备出含量较高的蛋白质，一方面，银杏叶蛋白质含有丰富的亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和色氨酸，该6种人体必需氨基酸的含量达424.89 mg/g蛋白质[9]，故从银杏叶提取物生产废弃液来提取蛋白质，变废为宝，为保健品、蛋白粉等开发以及作为精饲料的添加提供原料保证；另一方面，由于银杏叶生产废弃液中蛋白质含量较高，因此，通过从银杏叶提取物生产废弃液来提取蛋白质，可以增加蛋白质的来源途径。蛋白质是整个人类生命的物质基础，因此，无论是人类还是动物都离不开生命物质蛋白质，但是迄今为止，世界上仍然大约有1/5的人口缺乏蛋白质，蛋白质资源短缺和蛋白质来源匮乏显然已经是当今世界尤其是发展中国家亟须解决的重大问题。

因此，探索新的蛋白质资源途径具有非常重要的现实意义，故采用廉价原料、试剂与仪器，设计出合适的工艺路线，为蛋白质的生产打开新的大门，为蛋白质资源短缺提供缓冲的机会，同时也为厂家节约成本，实现经济效益最大化。因此有必要对银杏叶提取物生产废弃液中蛋白质的纯化工艺进行深入研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器及试剂 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、电子天平(赛多利斯科学仪器(北京))、紫外可见分光光度计(Cary 60 UV-Vis Agilent Technologies)、分液漏斗(泰州市康之达实验器材)等；乙醇(分析纯，重庆川东化工有限公司化学试剂厂)，正丁醇(分析纯，上海申博化工)，三氯甲烷(重庆川江化学试剂厂家)，氢氧化钠(天津市科密欧化学试剂有限公司)，酒石酸钾钠(成都金山化学试剂有限公司)，无水硫酸铜(天津市永大化学试剂有限公司)，乙酸乙酯(天津市富宇精细化工有限公司)等。

1.1.2 供试材料 酪蛋白对照品(上海广锐生物科技有限公司)；银杏叶提取物生产废弃液(浙江和陕西：厂家要求保密，不便于透露)。

1.2 方法

1.2.1 测定方法 本文选用双缩脲比色法测定银杏叶提取物生产废弃液中的蛋白质，其原理是：在碱性溶液中，蛋白质与铜离子产生紫红色反应，肽键越多反应就越明显。双缩脲试剂使用的是“1.2.1”中①项下配制的。使用电子天平精密称定浸膏并加纯水稀释，再加相应的双缩脲溶液反应，然后在560 nm波长处，用紫外分光光度计测其吸光度。根据回归曲线方程：y=0.064 5x-0.000 4，R2=0.998计算相应的浓度。再结合以下两个公式即可算出蛋白质的含量。

蛋白质质量(mg)=测定蛋白质浓度(mg/mL)× 样液体积(mL)

蛋白质含量=蛋白质质量(mg)/样品的质量(mg)×100%

(1)双缩脲试剂的配制：使用电子天平精密称定30.15 g氢氧化钠溶于300 mL水中得到A液，使用电子天平精密称定质量为5.99 g的酒石酸钾钠和质量为1.50 g的无水硫酸铜，然后溶解在500 mL的水中并混匀即得到B液，将A液和B液混合并摇匀即可得到双缩脲试剂。

(2)0.05 mol/mL氢氧化钠溶液使用电子天平精密称取0.60 g氢氧化钠溶于300 mL的蒸馏水中，搅拌混匀备用。

1.2.2 酪蛋白标准品溶液的制备 用分析天平精密称定1.49 g酪蛋白于制备好的0.05 mol/mL的氢氧化钠溶液当中，搅拌混匀即可得到标准品溶液。

1.2.3 样品溶液制备 将来自不同厂家的银杏叶提取物生产废弃物料液用旋转蒸发仪真空浓缩得浸膏备用。

1.2.4 线性关系考察 取7支具塞试管，按梯度要求精密移取酪蛋白标准溶液，然后向7支具塞试管中立即加入6 mL的双缩脲试剂，振荡均匀，各管加完后将其置于室温下反应，反应时间为30 min，然后在波长为560 nm下，以0管为空白对照，迅速逐一测量各管的吸光度。以标准品酪蛋白的浓度作为横坐标，以各管的吸光度值作为纵坐标，然后绘制标准曲线如图1：酪蛋白的线性范围为(0.50～5.00) mg·mL-1，结果显示R2>0.99具有良好的线性关系。

图1 酪蛋白标准曲线

2 结果与分析

2.1 银杏叶提取物生产废弃液中蛋白质含量的测定

将不同厂家的银杏叶提取物生产废弃液按上述“1.2.3”进行前处理，然后精密移取5 mL纯水加入“1.2.3”的样品中，然后再移取2 mL溶液，分别加入6 mL的双缩脲试剂，摇匀，静置30 min，再按“1.2.1”进行测定，结果见表1。

表1 两个厂家的银杏叶提取物生产废液中蛋白质含量

结果表明：厂家不同，银杏叶提取物生产废弃液中蛋白质含量不同，其中浙江厂家的蛋白质含量为3.93%～5.09%，陕西厂家为8.34%～14.10%，原因是两个厂家生产工艺不同，其中浙江厂家采用高浓度乙醇提取，而陕西厂家采用低醇提取。

2.2 银杏叶提取物生产废弃液中蛋白质分离纯化工艺研究

2.2.1 超滤纯化研究 200 kg银杏叶提取物生产废弃液浸膏，加纯水200 kg，搅拌均匀后进行超滤，中间补水3次，每次加200 kg纯水，透过液为超滤液，将该超滤液浓缩为浸膏。然后取样，在向装有样品的试管里加入5 mL纯水稀释，取出2 mL溶液，再加入双缩脲试剂，反应时间为30 min，再按“1.2.1”进行测定，结果见表2。

结果显示，原料1经过超滤后含量由3.93%提升到14.29%，原料2经过超滤后含量由8.34%提升到44.38%，采用超滤的纯化方式可以将蛋白质含量提升5倍左右，表明该方法对蛋白质的分离纯化有显著的作用，可以运用到蛋白质的分离纯化工艺当中。

2.2.2 萃取纯化研究 量取80 mL的纯水加入到装有64.70 g原料浸膏的烧杯中溶解，将溶液转移到分液漏斗中，再加入20 mL乙酸乙酯，双手托住分液漏斗，右手按住瓶塞，水平放置且上下振荡，并将分液漏斗倾斜45°，打开活塞，将气泡排除。然后将其放置在铁架台上，静置分层，等到分层足够明显时，将下层的液体从下面放出去，将上层的液体从上面倒出来，然后留样。重复上述操作4次。将每次的样品加入纯水稀释5倍，然后用移液管取出2 mL于比色管中，并加入6 mL的双缩脲溶液，反应30 min，再按“1.2.1”进行测定，结果见表3。

表3 萃取结果

结果表明，采用乙酸乙酯萃取来分离纯化银杏叶提取物柱层析废弃液中的蛋白质，是没有纯化效果，说明该原料液中溶于乙酸乙酯的有机物含量很少。

2.2.3 醇沉纯化研究 醇沉的原理：在蛋白质溶液中加入一定量与水可以互溶的乙醇，使蛋白质表面失去水化层相互聚集而沉淀[10]。精密称取浸膏165 g，在温度为80 ℃水浴中加入500 mL 95%乙醇。加入乙醇的同时要不停搅拌，然后在常温静置沉淀，到深棕色沉淀变为米黄色沉淀时，将上清液倾出，将沉淀部分进行取样。然后重复操作两次并取样。然后在向装有样品的试管里加入5 mL纯水稀释，取出2 mL溶液，再加入双缩脲试剂，反应30 min后，再按“1.2.1”进行测定，结果见表4。

表4 醇沉结果

从醇沉结果可以看出，含量从14.29%提升至34.62%，有显著的提升。从表5可以看出，醇沉次数对蛋白质的提升并没有显著的影响，结合生产成本、生产效率等方面的影响，选用醇沉次数为1次。

综上，最终蛋白质的分离纯化选用超滤和醇沉这两种方式。

3 结论

由上述结果可知，对银杏叶生产废弃液中蛋白质进行分离纯化时，采用乙酸乙酯萃取不会提高蛋白质的纯度，有效提高蛋白质纯度的方法主要是超滤和醇沉，经超滤和醇沉结合工艺进行银杏叶蛋白质的纯化，可以将蛋白质含量为8.43%的原料纯化蛋白质含量86.20%的产品。综上所述，对银杏叶提取物生产废弃液中蛋白质成分，采用超滤和醇沉进行纯化，就能够大幅提高蛋白质纯度，且操作简单可行，工艺路线稳定。

4 讨论

对银杏叶提取物生产的废弃液中的蛋白质进行提纯工艺研究，本论文采用银杏叶提取物生产废弃液为原料，分别采用萃取、超滤、醇沉三种方式进行纯化研究，萃取的方式对蛋白质的分离纯化没有显著的效果，说明原料中有机类物杂质很少；利用超滤的方式可以将蛋白质含量提升5倍左右，是利用了蛋白质分子量大，与小分子杂质可以有效分离；而醇沉的方式可以将蛋白质含量提高2倍左右，主要是利用了蛋白质不溶于高浓度乙醇的性质来纯化。