益生菌在马属动物中的应用及研究进展

张建强，苏少锋，，陶金山，吴海青，赵俊利，赵启南，翠 芳，程 超，李雅静，芒 来，赵一萍

（1.内蒙古农业大学动物科学学院/内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖重点实验室/农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站/内蒙古农业大学马属动物研究中心，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；3.阿鲁科尔沁旗动物疫病预防控制中心，内蒙古 阿鲁科尔沁旗 025550；4.集宁师范学院，内蒙古 集宁 012000）

马是单胃非反刍草食性动物，具有较发达的后肠（盲肠、结肠和直肠），肠道内有极其复杂的微生态系统，尤其是盲肠内微生物菌群多样性和丰富度最高，包含多种原生生物、古细菌、真菌、细菌等［1-6］。马靠后肠内的原生生物和微生物降解碳水化合物产生挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）为机体提供能量［7］，因此，马后肠有“发酵罐”之称。

许多马胃肠道疾病的发生可能与胃肠道内微生物群组成或功能的改变有关，马常见疾病，如肠梗阻、肠炎等与肠道菌群密切相关［8-10］。 菌群的平衡和稳定对维持胃肠道健康具有重要意义。 益生菌能够提高宿主对营养物质的利用率， 改善其生长性能，对维持胃肠道菌群平衡、净化肠道微生物环境、 保证肠道健康及调节宿主免疫系统有重要作用。随着2019 年农业农村部第194 号公告的发布，要求自2020 年禁止饲料企业生产及销售含有抗生长素类（中药类除外）的商品饲料，因此，饲料行业的全面禁抗时代已经来临［11］，替抗产品的研发成为热点。 益生菌具有安全性高、无残留、无耐药等特点， 作为一类抗生素替代品应用于马的饲料添加剂和马兽药生产， 对促进现代养马业的健康、绿色、可持续发展具有重要意义。 笔者对益生菌及相关活性物质的作用机理及马用益生菌产品存在的问题和应用前景进行综述， 旨在为马用益生菌产品的开发利用提供参考。

1 益生菌的概念

1.1 益生菌的定义和发展

益生菌（probiotics）是可以添加到饮食中改善肠道环境（特别是微生物区系平衡）的活微生物，在希腊语中意为“对生命有益”，其定义为人类或动物摄入后对宿主有正面效应的微生物。 早在1892 年，德国学者Doderlein 就已发现产乳酸的微生物对生物体有益［12］；1908 年，Elie 发现饮用酸奶的保加利亚人较长寿，并在其著作《Prolongation of Life》中系统阐述了该观点，提出了“益生菌”这一概念［13］；1965 年，Lilly 等［14］在《Science》杂 志 中首次使用“probiotic”一词并将其定义为由一种微生物产生的， 可以促进另一种微生物生长的物质；1989 年，Roy 提出新的概念，益生菌是一种活的微生物补充剂，可以对宿主产生益处［15］；联合国粮食及农业组织于2002 年与世界卫生组织共同起草了《食品益生菌评价指南》，将益生菌定义为活的微生物， 当宿主摄入足够的量会得到某种健康益处［16-17］。 目前，益生菌已成为全球发展最快的人类膳食补充剂和动物饲料添加剂［18］。

1.2 益生菌的分类及应用

根据菌种的不同， 益生菌可以分为芽孢杆菌类、肠球菌类、乳酸菌类、大肠杆菌类、霉菌类、酵母菌类、放线菌类，应用最广泛的是乳酸菌类、酵母菌类和芽孢杆菌类； 根据产品可分为单一菌种产品和混合菌种产品。 美国食品与药品监督管理局和美国饲料管理协会公布的可以直接饲喂且安全的菌种有43 种；在欧洲市场上的益生菌产品已有50 多种；列入我国《饲料添加剂品种目录》的有地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、 双歧杆菌（Bifidobacterium）、酵母等35 种微生物，适用范围为养殖动物、青贮饲料等。

1.3 益生元、合生元和后生元的发展

随着益生菌产品的不断发展， 人们又提出了益生元、合生元和后生元等概念。 1995 年，Gibson提出了益生元的概念；2004 年，Gibson 等将益生元（prebiotics）定义为一种不能被吸收消化，但能有选择地促进宿主机体内有益微生物的代谢和增殖，改善宿主健康的有机物质。益生元是一种膳食补充剂，包括特定益生菌发酵的营养物质，可以促进益生菌的繁殖，调节胃肠道微生态平衡，加强物质（脂质、蛋白质等）代谢，多应用于食品、饲料等领域。 益生元对乳酸菌（如乳酸杆菌、双歧杆菌和肠球菌）的生长有促进作用。益生元制剂的潜在优点是不依赖活的微生物细胞，因此，在饲料加工和储存过程中没有严格要求。

1995 年，Gibson 提出了合生元（synbiotics）的概念。合生元又称合生素，是多种益生菌或微生物的混合产品，对宿主起有益作用，是由益生菌与益生元组合而成［19-20］。 合生元兼具益生菌和益生元的优良作用，能够同时发挥二者的双重作用。最新研究表明，除了益生菌等活菌体，它们的裂解提取物、代谢产物、细胞壁组分、培养上清液等也都表现出明显的益生作用， 且不同组分的益生作用机制各不相同［21-22］。 有学者提出了后生元（postbiotics）的概念，即生物后体，包括代谢物和细胞壁成分，由活细菌分泌或在细菌裂解后释放，在宿主体内显示出有益活性［23-24］。 目前，乳酸乳球菌细菌素—乳酸链球菌素是所有细菌素中研究最广泛、商业利用最广泛的一种， 在生物保护方面的应用已获得欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA） 和美国食品与药品监督管理局（FDA）的批准［25］。

总之， 益生菌可有效改善机体内微生态的平衡、发挥益生作用。 益生元可促进益生菌的增殖。两者混合形成合生元， 合生元产生的物质 （后生元）依然具有益生性，其相关互作模式见图1。

图1 益生菌、益生元、合生元、后生元模式图

2 益生菌的作用机理

2.1 抑制有害菌的定植

肠道微生物对病原体的抑制包括细菌拮抗、细菌干扰、屏障效应、定植抗性和竞争排斥等作用［16］。益生菌进入宿主体内，会迅速在胃肠黏膜定植， 抵制有害菌的生长和繁殖。 Weese 等［26］和Carucci 等［27］研究表明，益生菌可以调节肠道致病菌和非致病菌的菌群平衡，抑制致病菌的入侵、预防炎症，起到生物屏障的作用。

2.2 提高免疫力

宿主的免疫力与益生菌有关， 因其可以刺激机体产生特异性以及非特异性免疫反应， 同时促进自然杀伤细胞活性、激活巨噬细胞等，进而改变全身性T 细胞平衡，提高免疫球蛋白水平，同时能够增强上皮组织的屏障功能，促进免疫球蛋白IgA的上调和促炎因子的下调［28-29］。 临床研究表明，乳酸菌能够诱导保护性免疫反应并增强机体对病毒感染的抵抗力， 有作为疫苗佐剂及疫苗的开发潜力［30］。 实验室益生菌作为抗病毒药物已经应用于水产养殖［31］和家禽生产［32］，因此，益生菌及补充剂在预防和治疗动物肠道疾病中起到至关重要的作用，也越来越多地应用于人医和兽医［33］。

2.3 改善肠道菌群结构

肠道菌群是指寄居在宿主肠道内由多种微生物构成的生物群落， 它们与宿主共生， 可诱导摄食、调控机体代谢［34］。肠道菌群参与宿主体内多种营养物质（糖、脂、蛋白质等）的代谢，还参与免疫调控以及炎性反应［35］。 有益菌在体内可直接影响消化系统健康。益生菌被宿主摄入后，可显著增加肠道菌群的多样性和丰富度。 益生菌在胃肠道内大量繁殖，并迅速在宿主肠道内形成优势菌群，进而改变肠道菌群结构，保证宿主的肠道健康［36］。

2.4 修复肠道黏膜

肠道不仅是动物消化吸收的场所，也是重要的免疫器官。肠道黏膜面积十分庞大，这种结构与其功能组成了肠道巨大的黏膜免疫系统。 肠道中有大量的微生物菌群， 使外源病毒和细菌很难突破这道防线，从而阻止细菌对生物体产生危害［37-39］。

益生菌可以定植在肠道内，平衡肠道菌群，刺激肠黏膜免疫组织，改善宿主肠道微生态环境，增强肠道屏障功能。研究表明，不同种类的益生菌对胃肠黏膜的结构改变能力不同［40］。 双歧杆菌能通过细胞的磷酸壁与肠黏膜上皮细胞特异性结合占据肠黏膜表面，形成与肠上皮细胞连接的细菌生物膜，阻止各种致病菌、条件致病菌的定植和入侵［36，41］。

2.5 产生营养物质

益生菌除了能够增强动物肠道功能、 提高抗氧化能力和免疫力，还可作为营养性饲料补充剂。益生菌可直接补充动物体营养， 也可通过调节肠道的微生物菌群和促进消化酶的活性提高营养物质在机体内的消化吸收率。有研究表明，在动物日粮中添加酵母菌显著提高了粗蛋白质、 脂肪等物质的消化率， 可见益生菌对营养物质的吸收具有明显的促进作用［42-44］。

3 益生菌对马的作用

3.1 提高马的耐力

随着现代马业的发展，赛马和马术运动在全世界受到欢迎，而与马相关的运动对马的耐力有较高的要求。运动性能的好坏是衡量纯血马优劣的主要标准，除了选择育种能优化马的性能特征［45］，还能通过补充益生菌提高马的耐力和比赛性能［46-48］。在运动马的日粮中添加酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等益生菌可增强抗疲劳能力，提升耐力［49］。 适度运动后补充益生菌的马心率比未补充的低15%～20%， 且补充益生菌的马有氧运动耗氧量增加［50］。 Rezende 等［51］在研究酵母菌对训练马营养物质消化率和代谢性能的影响时发现，接受活酵母菌的马营养物质消化率得到提高，且经训练表现出更高的疲劳耐受力， 摄氧量也明显增加。

3.2 调节肠道菌群平衡

马肠道的微生态环境保持在一个动态平衡的状态，容易受到压力、药物和环境的影响。饮食、疾病、 应激和环境等因素很容易破坏马胃肠道中的微生物菌群结构， 导致肠道健康失衡和疾病的发生，进而影响马的健康。 有研究表明，纯血马与蒙古马的肠道微生物多样性不同， 同一马种的不同肠道区段的菌群多样性也不同， 可见品种和肠道部位也是影响马肠道菌群的因素［52-53］。目前，益生菌在马胃肠道恢复正常菌群及重建肠道稳定和平衡等方面发挥重要作用，但益生菌影响马胃肠道菌群环境的研究非常有限［54］。 健康马肠道中的放线菌（Actinobacteria）和螺旋菌（Spirochetes）相对丰度显著高于有肠炎的马，而患结肠炎马的梭形菌（Fusobacteria）相对丰度较高，梭状芽孢杆菌（Clostridium）在健康马肠道中更多［55］。

3.3 预防和治疗马腹泻

马驹在刚出生时，由于肠道菌群单一、免疫系统和器官发育不完善经常发生腹泻。 马驹的消化道疾病主要是由病原菌感染引起的， 沙门菌（Salmonella）和大肠杆菌（Escherichia coli）是导致马腹泻和败血症的主要原因［56］，添加益生菌可显著降低马驹的腹泻率。研究表明，给患肠炎的马饲喂酵母菌可减少持续腹泻的时间。 在怀孕母马的饮食中补充益生菌可影响马驹出生后胃肠道中的微生物多样性并减少腹泻［57］。

3.4 提高马的生产性能

益生菌不仅可以维持马胃肠道内微生物平衡，还能改善饮食消化、生长性能并且促进生长。有研究表明，在马的日粮中，添加益生菌（活酵母）可以促进对干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、半纤维素、酸性洗涤纤维和磷的消化和吸收，加快马的生长［51］。

4 马用益生菌添加剂

4.1 酵母添加剂

在马饲粮中添加活酵母菌可显著提高马饲料消化率及生产性能，增加采食量、减少肠道致病菌数量，同时减少马业生产对环境的负面影响［58-60］。研究表明， 给马饲喂酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） 可以增强对纤维素和半纤维素的降解消化能力， 可有效抑制消化系统中有害厌氧菌的生长， 且酿酒酵母在盲肠中的浓度高于结肠［61］。Desrochers等［62］研究表明，添加布拉迪酵母菌（Saccharomyces boulardii）可显著缩短患小肠炎和结肠炎的马持续腹泻的时间。

4.2 芽孢杆菌添加剂

枯草芽孢杆菌PB6 对马红球菌（Rhodococcus equi）、马链球菌（Streptococcus equi）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、艰难梭菌（Clostridium difficile）4 种马源细菌病原体有显著的抑制作用［63］。 表达Cry5B 蛋白的灭活苏云金芽孢杆菌可使感染寄生虫的马驹粪便中蛔虫卵的数量减少，具有潜在的益生特性［64］。 国内团队首次从蒙古马盲肠道中分离筛选到解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），并对其酶学特性、产酶特性进行深入研究， 为马源益生菌的深度开发和纤维素酶的工业化生产提供了试验依据［6］。 目前，虽然芽孢杆菌（Bacillus spp）不会在马的肠道中定植，但可以在这种环境中生存， 通过马小肠的时间很快（1～3 h），但通过后肠的时间可长达2 d，为孢子萌发和抗菌分子产生提供了足够的时间，因此，芽孢杆菌的益生功能需要更多的体内疗效试验证实。

4.3 乳酸菌添加剂

研究表明，在马的日粮中添加马乳杆菌（Lactobacillus equi）、 脆裂乳杆菌 （Lactobacillus fragilis）、约翰逊乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）、罗伊乳杆菌（Lactobacillus reuteri）和唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius），在促进马生长和抵抗腹泻方面发挥重要作用［65］。目前，商品化的马用益生菌通常由乳酸杆菌（Lactobacillus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）及肠球菌（Enterococcus）等组成［66］。 卷曲乳杆菌 （Lactobacillus frizzled）、 约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）、 罗 伊 乳 杆 菌（Lactobacillus reuteri）和唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）等广泛应用于马产业， 可以促进宿主生长和抵抗肠道疾病［67］。在国外，马用乳酸工程菌添加剂方面的研究较少；在国内，苏少锋［6］通过分子生物学方法成功构建乳酸菌食品级双筛选标记的分泌型表达系统E.faecalis 19855/NN1-1（pMG36e-Emr+p32+usp45+melA+NisI）（见图2），并实现了马源解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）中经密码子优化的纤维素酶基因在该系统中的分泌表达，为马用食品级工程菌的研制、开发和应用奠定了基础，为新型功能性微生物发酵剂开发提供了依据［68-69］。乳酸菌表达外源基因的转化效率不理想及所用载体缺少高表达调控元件严重阻碍了该领域的发展。 目前， 多数研究集中在乳酸菌表达载体的构建，其应用方面研究很少［70］。随着微生物生物技术及交叉学科的不断发展， 开发功能性重组微生物和合成微生物将成为热点， 并能广泛应用到养马业中。

图2 纤维素酶基因食品级双筛选标记表达载体的构建[6]

4.4 益生元添加剂

低聚果糖（fructo-oligose）和菊粉（synanthrin）是优质的马用益生元产品，可以调节马后肠发酵。益生元选择性地刺激后肠某些微生物生长的活性成分，具有保持健康的作用［67］。低聚果糖和菊粉等在马后肠道中被微生物发酵降解， 可促进盲肠和结肠中乳酸菌的生长， 减少肠道微生物群失衡的风险［71］，在前消化道不被消化，才能在压力环境下维持后肠健康。

4.5 其他添加剂

马的饲料中添加沙柳醇（杨柳提取物），能在一定程度上改变马肠道微生物的丰富度，并增加肠道微生物群多样性［72］。 粪便微生物移植（fecal microbial transplantation，FMT）是指将粪便悬浮液从健康供体转移到受体肠道，接受健康体有益微生物治疗疾病的方法，这种方法已应用于兽医领域。 FMT 应用于马的研究报道极少，但这种治疗形式可能对患有急性结肠炎或慢性腹泻的马有效［73-74］。 最新的研究表明，接受FMT 治疗的马粪便微生物多样性更高，且与供体的微生物组成更相似［75］。

5 马用益生菌存在的问题及应用前景

有数据显示，当前全球益生菌补充剂行业规模达3 000 亿元人民币，2019 年全球动物用益生菌市场规模达到了150 亿元人民币， 预计2026年将突破200 亿元人民币。2019 年我国益生菌市场规模达到20 亿元人民币，预计2026 年将达到35 亿元人民币。 我国动物益生菌产品在2019 年和2020 年销量突飞猛进， 预估未来市场份额会增加， 说明今后的畜牧生产中益生菌会大有作为，马用益生菌企业应当顺势而上，为畜牧生产创 收［76-77］。

随着人们安全意识的提高， 动物健康化养殖和福利化养殖程度不断提高， 兽药和饲料添加剂安全成为畜牧工作的重中之重。当前，全球的益生菌行业发展迅速， 但缺少标准， 产品质量参差不齐，存在以次充好的现象［78-79］。 市场上的动物益生菌制品，鲜有马用益生菌制剂，多数为猪、牛、羊等使用的益生菌添加剂制品［80-83］。 在益生菌研究中，选择正确的菌株、 各种菌株优化组合及添加浓度等因素共同影响益生效果， 需要进一步研究。 目前， 马用益生菌产生益生效果的最少微生物量尚未达成共识［84］，后续可开发马用益生菌，并广泛应用于马产业。

6 小结

抗生素替代产品的广泛需求使益生菌产品成为新宠，其研究热度和投入逐年增加。 目前，马用益生菌在马的耐力提升和营养补充方面已经明确益生功效，因此，可以应用于赛马和其他马。 马用益生菌具有预防和治疗腹泻的功效， 可为安全有效的兽药研发提供更多选择。 马用益生菌能促进现代马业的可持续发展，为畜牧生产创收。马不同肠道部位微生物菌群的作用及影响还不明确，需要对马用益生菌进行更深入的研究。