MEBT／MEBO联合八珍汤加减对Ⅲ～Ⅳ期压疮创面组织中CK19表达水平的影响

冯晓琪 侯玉洁 王玉玲 刘 宁 向丽萍

压疮是指由于压力或压力结合剪切力导致的局部上皮、真皮和皮下组织损伤［1］，感染风险较高、愈合时间较长，给患者造成了较大的身心痛苦及经济负担，严重影响了患者的生活质量。目前，临床常用的西医压疮治疗方法中常规清创换药的治疗效果缓慢，敷料外敷、干细胞疗法及负压封闭引流的治疗效果虽有所提高，但费用高昂，且适用范围较小。而中医以内治补益气血、扶正托毒为法，外治拔毒生肌为要，辨证施治、内外结合，在促进压疮愈合中发挥了重要作用，逐渐被临床所重视。如创疡再生医疗技术 （moist exposed burn therapy／moist exposed burn ointment， MEBT／MEBO） 作为中医外治疗法之一被诸多研究证实可促进表皮干细胞的增殖，加快创面愈合［2－3］；八珍汤加减作为中医内治疗法之一被多项研究证实在Ⅲ～Ⅳ期压疮的治疗中具有较好的临床疗效。本研究主要探析 MEBT／MEBO与八珍汤加减联合治疗Ⅲ～Ⅳ期压疮的临床效果及其对创面组织中细胞角蛋白19（cytokeratin⁃19，CK19）表达水平的影响，现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料

选取2021年3月至2022年1月湖南中医药大学第二附属医院收治的45例Ⅲ～Ⅳ期压疮患者作为研究对象，采用随机数表法将其随机分为治疗组23例和对照组22例。两组患者性别、年龄、创面面积等一般资料对比，P均＞0.05，差异无统计学意义，具有可比性 （表1）。本研究经湖南中医药大学第二附属医院医学伦理委员会批准 （批号2021⁃KY⁃017），且所有患者或家属均签署了知情同意书。

表1 两组Ⅲ～Ⅳ期压疮患者一般资料对比Table 1 Comparison of general data of patients with stageⅢ－Ⅳ pressure ulcer between the two groups

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：符合美国国家压疮顾问小组压疮指南中压疮的诊断标准［4］，且分期为Ⅲ～Ⅳ期；符合《中医外科学》［5］中气血亏虚证型的诊断标准；年龄在18岁以上；对本研究知情同意；生命体征平稳；压疮病程小于1年。排除标准：创面存在窦道，无法准确测量创面面积；合并有严重营养不良、重度贫血、脏器功能衰竭、凝血功能障碍；长期接受放化疗或免疫抑制剂、激素治疗；创面存在严重感染或已出现全身感染症状；对本研究所用药物成分过敏或为过敏体质；患有精神疾病，依从性差，无法配合完成全程治疗；妊娠期或哺乳期女性。

1.3 主要仪器与药品

湿润烧伤膏 （moist exposed burn ointment，MEBO）：汕头市美宝制药有限公司生产，国药准字Z20000004；中药八珍汤加减：黄芪30 g、薏苡仁30 g、茯苓20 g、党参15 g、当归10 g、白术10 g、白芍10 g、川芎10 g、金银花10 g、白芷10 g、甘草6 g加入1500 ml纯净水煎40 min得150 ml药液滤出，再次加入1200 ml纯净水煎30 min得150 ml药液滤出，两次药液混合，每袋150 ml包装，4℃冰箱冷藏备用，湖南中医药大学第二附属医院煎药室自动煎药机煎制；羊抗兔⁃辣根过氧化物酶标记二抗：北京博奥森生物技术有限公司生产， 货号 bs⁃0295G⁃HRP； 羊抗兔⁃CK19： 英国abcam生产，货号ab52625；羊抗兔⁃甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（glyceraldehyde⁃3⁃phosphate dehydrogenase， GAPDH）、电泳仪、电转仪：安诺伦 （北京）生物科技有限公司生产， 货号 10494⁃1⁃AP、 1645070、 BE6085；2， 2⁃联喹啉⁃4， 4⁃二甲酸二钠 （bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒：北京索莱宝科技有限公司生产，货号PC0020；放射免疫沉淀法 （radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物、Tris⁃甘氨酸电泳缓冲液、超敏电化学发光 （electro⁃chemi⁃luminescence， ECL）发光液：上海碧云天生物技术有限公司生产，货号P0013B、 P1045、 P0015L、 P0018S⁃2； 四甲基乙二胺：美国Amresco生产，货号Amresc00761；三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸钠：国药集团化学试剂有限公司生产，货号 30188216、62011519、30166428；膜再生液：北京普利莱基因技术有限公司生产，货号P1650；聚偏氟乙烯膜：美国Millipore生产，货号IPVH00010；酶标仪：美国Biotek生产，货号800TS；Tanon 5200型全自动化学发光图像分析系统：上海天能科技有限公司生产。

2 方法

2.1 治疗方法

所有患者根据具体病情予以调节血压、血糖，改善微循环等基础治疗，以及使用气垫床，定时翻身等护理。

对照组：局部创面及创周5.0 cm范围内于络合碘消毒、无菌干纱布拭净创面分泌物后，以不破坏正常组织、无明显疼痛及出血为准，用镊子和刀片逐步清除创面坏死组织，并再次用无菌纱布拭净创面后，均匀涂抹湿润烧伤膏 （厚约0.2 cm），依次覆盖湿润烧伤膏药纱及无菌敷料包扎，每天换药2次，连续治疗4周。

治疗组：在湿润烧伤膏换药治疗的基础上加服八珍汤加减治疗，每次150 ml温服，每天2次，连续治疗4周。

2.2 Western blotting法检测创面组织中CK19表达水平

分别于治疗前及治疗后第1、2、3、4周，创面常规消毒清创后，切取8.0 mm×2.0 mm×1.0 mm创缘组织，迅速置于－80℃液氮中保存；标本收集完毕后，取适量组织，裂解、离心后取上清液，严格按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度，加入上样缓冲液和磷酸盐缓冲液调整蛋白浓度，保证不同组别间浓度一致，95℃煮5 min上样。制作电泳胶，每孔加入10 μl上样，80 V浓缩胶、120 V分离胶，恒压电泳至目的蛋白处于分离胶面下1／3时停止；PVDF转膜、摇床、封闭，4℃一抗孵育过夜，TBST充分洗膜3次；封闭液10000∶1稀释辣根过氧化物酶标记二抗，二抗孵育1 h，TBST洗膜3次；1∶1比例混匀ECL发光液与过氧化物酶溶液，滴于PVDF膜上，用全自动化学发光图像分析系统曝光，TBST洗膜3次；加入膜再生液，室温摇床30 min洗脱，再次封闭、内参孵育 （GAPDH⁃1∶5000）；最后，使用Image J图像分析软件分析蛋白条带灰度值。

2.3 观察指标及评价标准

（1）使用压疮愈合计分量表 （pressure ulcer scale for healing， PUSH）［6］评估压疮创面愈合情况，主要包括压疮面积、24 h渗液量、创面组织类型3个维度，总分为17分，分值越低表示愈合情况越好。

（2）治疗4周后，评估两组患者临床疗效：创面愈合为痊愈；创面面积明显缩小，PUSH评分降低，渗液量减少或渗液消失，肉芽组织生长良好为有效；创面无明显变化或扩大为无效；总有效率＝（痊愈例数 ＋有效例数） ／总例数 ×100%［7－8］。

2.4 统计学处理

采用SPSS 23.0统计软件对所得数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数 （下四分位数，上四分位数） 即 Q2（Q1，Q3） 表示， 采用 Mann⁃Whitney检验；计数资料以频数或百分比表示，采用卡方检验或等级资料的秩和检验；均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 创面组织中CK19表达水平对比

治疗后，两组患者创面组织中CK19表达水平均呈先降低后升高又降低的趋势，且治疗2、3、4周时治疗组患者创面组织中CK19表达水平均明显高于对照组 （P均＜0.05），详见表2、图1。

图1 创面组织中CK19表达水平条带图Fig.1 Histogram of CK19 expression levels in wound tissues

表2 两组Ⅲ～Ⅳ期压疮患者创面组织中CK19表达水平对比 ［Q2（Q1，Q3）］Table 2 Comparison of expression levels of CK19 in wound tissues of patients with stageⅢ－Ⅳ pressure ulcer ［Q2 （Q1， Q3）］

3.2 创面PUSH评分对比

治疗前，治疗组患者创面PUSH评分为（13.04±2.14）分，对照组患者创面PUSH评分为（13.86±1.78）分，两组间无明显差异 （t＝－1.393，P＝0.171），具有可比性；治疗4周后，治疗组患者创面PUSH评分为 （9.21±2.15）分，明显低于对照组患者的创面PUSH评分 （11.77±1.85）分（t＝ －4.262，P＜0.001）。

3.3 临床疗效对比

治疗4周后，治疗组患者中有效22例、无效1例，总有效率为95.65%，明显优于对照组患者的有效12例、无效10例，总有效率54.55% （Z＝－3.172，P＝0.002）。

4 讨论

随着我国人口老龄化的不断加剧，压疮的发病率也随之升高。有研究数据显示，我国压疮患病率为1.577%，已成为危害人类健康及社会发展的重要影响因素。中医学中，压疮又称 “席疮” “褥疮”，认为气血亏虚、运行不畅致局部经络阻滞、肌肤失养而破溃是其主要病机，感染毒邪而正虚无力驱邪外出可致久病难愈，补益气血、扶正托毒（“补托”）为内治之则，化腐生肌为外治之法。“补托法”体现了中医扶正祛邪之整体观念，在清解毒邪时，重视扶助正气以祛邪外出，谨防毒邪内陷，病情迁延。同时，运用补益药还有助于后期腐肉尽去后敛疮生肌。本研究笔者鉴于八珍汤作为治疗气血两亏诸证之经典方，具有补气养血、扶正托毒之效，且现代医学研究发现其有改善血液流变性、抗氧化和抗衰老、增强免疫力等效果，在贫血、创伤、肿瘤、疲劳等慢性损耗性疾病的治疗中取得了较为满意的临床疗效［9］，将其与 MEBT／MEBO联合应用于压疮患者的治疗。

MEBT／MEBO作为中医外治法化腐生肌的典型代表，最初应用于烧伤的救治，后被广泛应用于各种急慢性创面的治疗，可促进表皮干细胞的增殖、血管的新生、炎症的消退［3］，且其内含有的黄连、黄芩、黄柏除可清热解毒燥湿外，还具有较强的抑制金黄色葡萄球菌的作用［10］；地龙除可活血化瘀外，还可促进创面巨噬细胞聚集［11］。八珍汤加减以八珍汤为基础，加入黄芪增强补气、金银花清热解毒、薏苡仁清热利湿、白芷敛疮生肌；人参更换为党参，和缓其作用，如 《本草纲目拾遗》记载党参不如人参有 “甘温竣补之功”却有 “甘平清肺之力”，更适体质虚弱的患者，以避免虚不受补。且现代药理学认为，金银花对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等致病菌有明显抑制作用［12］；白芷、薏苡仁亦具有广谱抗菌、抗炎、镇痛作用［13－14］；党参与人参作用相似，可互相替代［15］。本研究结果显示，治疗2、3、4周时采用MEBT／MEBO联合八珍汤加减治疗的治疗组患者创面组织中CK19表达水平均明显高于单纯采用MEBT／MEBO治疗的对照组，治疗4周后治疗组患者创面PUSH评分明显低于对照组、临床疗效明显优于对照组。

CK19是表皮干细胞分化为单层上皮细胞后特异性表达的一种结构蛋白［16］，可用于检测创面组织中表皮干细胞的增殖和分化能力，评估创面愈合情况。表皮干细胞主要存在于表皮基底层和汗腺、毛囊周围，可分化为皮肤基底层细胞和毛囊、腺体细胞以及表皮细胞。本研究说明，与单纯应用MEBT／MEBO相比，MEBT／MEBO联合八珍汤加减更有利于表皮干细胞的增殖分化，且考虑与八珍汤可促进表皮生长因子的释放［17］有关。另外，八珍汤温补作用缓和不竣烈，临床中治疗气血不足等亏损性证候多需2周以上时间［18］，故初期作用不明显，2周后两组间才出现明显差异。此外，两组组内不同时间点CK19表达水平变化趋势大致相同，说明八珍汤并未改变CK19的基本变化趋势。而既往相关动物实验中CK19变化趋势与本研究结果有一定差异，如单云龙［19］研究结果显示的慢性难愈合创面大鼠经 MEBT／MEBO治疗后创面组织中CK19表达水平为先降低后升高趋势，唐乾利等［20］研究结果显示的慢性难愈合创面大鼠经MEBT／MEBO治疗后创面组织中CK19表达水平为先升高后降低趋势。分析其原因可能与研究对象不同以及压疮病程、基础情况个体差异较大有关。另外，患者入院后需视情况进行清创，难以避免造成的微小新创伤可对CK19总体变化趋势产生影响。

综上所述，MEBT／MEBO联合八珍汤加减可促进Ⅲ～Ⅳ期压疮创面愈合，其机制可能与两者联合应用促进表皮干细胞分化及CK19表达的作用更强有关。因现实条件限制，本研究样本量有限，两组患者个体差异难以精确控制，仍需进一步增加样本量、扩大研究方向深入研究验证。