血清lncRNA GAS5水平与2型糖尿病患者心血管疾病风险的相关性

张伟 韩洁 孙茜 许婧 曹宁 彭丽雅

糖尿病患者心血管疾病（cardiovascular dis⁃ease，CVD）的患病风险较非糖尿病人群增加约2～4 倍，且许多研究表明，2 型糖尿病是CVD 的危险因素［1⁃2］。因此，早期发现和预防性治疗是降低糖尿病CVD 发生风险的关键。长链非编码RNA生长停滞特异性转录本5（long non⁃coding RNA growth arrest specific transcript 5，lncRNA GAS5）不仅具有抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的作用，还在自身免疫性疾病、内分泌性疾病等非肿瘤疾病中发挥重要功能［3⁃5］。此外，lncRNA GAS5还参与心肌成纤维细胞的增殖、分化，与CVD 的发生发展可能有密切联系［6］。本研究通过对2型糖尿病患者进行为期两年的随访，探究其血清lncRNA GAS5 与CVD 发生的相关性，以期为改善2 型糖尿病患者预后提供依据。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年8月至2019年6月河北中石油中心医院收治的2 型糖尿病患者248 例，根据随访2年期间是否发生CVD 将患者分为CVD 组106 例和非CVD 组142 例，其中CVD 组患者年龄46～76岁；非CVD 组患者年龄45～77 岁。纳入标准：①患者均符合《2 型糖尿病基层诊疗指南》［7］；②CVD 患者纳入时需接受内科医师对其进行问卷调查，主要包括：有缺血性心脏病、心绞痛、心肌梗死等冠状动脉疾病，短暂性脑缺血发作、出血性脑卒中等脑血管疾病，静息痛、间歇性跛行等周围血管性病变；此外还需对其进行体格检查，颈动脉、心电图及下肢超声检查等进一步确诊；③患者依从性较好，可配合完成实验。排除标准：①入组时已有CVD 者；②1 型糖尿病或伴有其他内分泌疾病；③有严重脏器功能不全、肿瘤、结核、感染及自身免疫性疾病；④妊娠及哺乳期妇女。收集并整理2型糖尿病患者一般临床资料，主要包括年龄、性别、体质量指数（body mass index，BMI）、糖尿病病程、吸烟、收缩压、舒张压、心血管疾病家族史。患者签署书面知情同意书。研究经院临床研究伦理委员会批准，符合伦理学标准。

1.2 研究方法

1.2.1 实验室指标测定

低密度脂蛋白胆固醇（low⁃density lipoprotein cholesterol，LDL⁃C）、高密度脂蛋白胆固醇（high⁃density lipoprotein cholesterol，HDL⁃C）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、肌酐水平采用全自动生化分析仪检测；空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）水平采用葡萄糖氧化酶法检测（检测仪器为全自动生化分析仪）；糖化血红 蛋 白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）采 用HbA1c 分析仪检测；肾小球滤过率估算值（estimat⁃ed glomerular filtration rate，eGFR）=141×（血肌酐/0.9）⁃1.209×（0.993）年龄，检测步骤均严格按照仪器说明书进行。

1.2.2 血清lncRNA GAS5 表达水平测定

采集各患者入组时空腹静脉血液样本，3 000 r/min 离心15 min（离心半径为10 cm）后收集上层血清，-80℃保存。采用实时荧光定量PCR（quanti⁃tative real⁃time PCR，qRT⁃PCR）法检测血清ln⁃cRNA GAS5 表达水平。RNA 提取试剂盒提取血清总RNA，反转录试剂盒将其反转录为cDNA，内参为GAPDH，引物序列见表1，由大连宝生物工程有限公司合成。qRT⁃PCR 反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃30 s，72℃1 min，45 个循环。qRT⁃PCR 反应体系：cDNA（50 mg/L）2 μL，qPCR SYBR®Green Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。

表1 qRT⁃PCR 引物序列Table 1 qRT⁃PCR primer sequence

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件对数据进行统计分析；计量资料符合正态分布，以（）表示，采用t检验；计数资料以n（%）表示；采用卡方检验；相关性采用Pearson 法及Spearman 法分析；血清lncRNA GAS5水平对2 型糖尿病患者CVD 的预测价值采用受试者工作特征曲线（ROC）分析；影响2 型糖尿病患者发生CVD 的因素采用单因素及多因素Logistic 回归分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CVD组与非CVD组一般资料及实验室指标比较

两组性别、年龄、糖尿病病程、吸烟、收缩压、舒张压、HDL⁃C、TG、TC、HbA1c、FPG、eGFR、心血管疾病家族史比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。CVD 组BMI、LDL⁃C 高于非CVD 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 CVD 组与非CVD 组一般资料及实验室指标比较［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of general data and laboratory indicators between the CVD group and the non⁃CVD group［n（%），（±s）］

表2 CVD 组与非CVD 组一般资料及实验室指标比较［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of general data and laboratory indicators between the CVD group and the non⁃CVD group［n（%），（±s）］

项目男性年龄（岁）BMI（kg/m2）糖尿病病程（年）吸烟收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）LDL⁃C（mmol/L）HDL⁃C（mmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）HbA1c（%）FPG（mmol/L）eGFR（mL/min/1.73 m2）心血管疾病家族史非CVD 组（n=142）60（42.25）65.42±10.07 23.88±2.67 7.39±0.62 42（29.58）140.25±20.66 79.46±12.51 3.67±0.82 1.09±0.48 2.78±0.62 5.79±1.36 8.23±1.64 8.94±2.36 110.24±22.56 40（28.17）CVD 组（n=106）42（39.62）65.65±9.48 25.72±3.46 7.51±0.67 36（33.96）143.92±21.17 82.37±10.95 4.39±0.46 1.06±0.45 2.80±0.41 5.88±1.45 8.30±1.72 9.02±2.43 114.38±23.81 29（27.36）t/χ2值0.173 0.182 4.727 1.457 0.541 1.369 1.910 8.133 0.500 0.288 0.501 0.326 0.261 1.396 0.020 P 值0.677 0.855 0.000 0.147 0.462 0.172 0.057 0.000 0.618 0.773 0.617 0.745 0.794 0.164 0.888

2.2 CVD组与非CVD组血清lncRNA GAS5水平比较

CVD 组（1.00±0.21）血清lncRNA GAS5 水平低于非CVD 组（0.68±0.19），差异有统计学意义（t=12.360，P＜0.05）。

2.3 2 型糖尿病并发CVD 患者血清lncRNA GAS5与一般资料及实验室指标相关性

Pearson 法及Spearman 法分析结果显示，2 型糖尿病并发CVD 患者血清lncRNA GAS5 与BMI、舒张压、LDL⁃C、TG 呈负相关（P＜0.05）。见表3。

表3 2 型糖尿病并发CVD 患者血清lncRNA GAS5 与一般资料及实验室指标相关性Table 3 Correlation of serum lncRNA GAS5 with general data and laboratory indicators in patients with type 2 diabetes complicated with CVD

2.4 血清lncRNA GAS5 水平对2 型糖尿病患者CVD 的预测价值

以血清lncRNA GAS5 为检验变量绘制ROC 曲线显示，血清lncRNA GAS5 预测2 型糖尿病患者CVD 的AUC 为0.844（95%CI：0.795～0.892），截断值为0.801，特异性为0.82，敏感度为0.75。见图1。

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

2.5 影响2 型糖尿病患者发生CVD 的单因素及多因素Logistic 回归分析

单因素Logistic 回归分析，结果显示，lncRNA GAS5、BMI、舒张压、LDL⁃C、TG 与2 型糖尿病患者发生CVD 有关（P＜0.05）。以单因素Logistic 回归分析结果中有统计学意义的lncRNA GAS5、BMI、舒张压、LDL⁃C、TG 为自变量进行多因素Logistic 回归分析，结果显示，BMI 是2 型糖尿病患者发生CVD 的独立危险因素（P＜0.05），lncRNA GAS5 是2 型糖尿病患者发生CVD 的保护因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响2 型糖尿病患者发生CVD 的因素Logistic 回归分析Table 4 Logistic regression analysis of single factor affecting the occurrence of CVD in patients with type 2 diabetes

3 讨论

随着目前生活水平的提高以及生活方式的转变，糖尿病发病率急剧升高［8］。CVD 主要包括心血管病变、脑血管病变以及周围脏器血管性病变，其不仅是糖尿病患者的重要大血管病变之一，同时也是引起糖尿病患者残疾及死亡的重要因素［9⁃10］。探索预测CVD 发生风险的指标对2 型糖尿病患者长期预后有重要作用。

临床显示心肌纤维化是多种心脏疾病的病理生理基础，也是心肌重构的重要特征［11⁃12］。Zhu等［13］研究显示，lncRNA GAS5 可通过靶向miR⁃26a/b⁃5p 调控糖尿病心肌病的心肌细胞凋亡及纤维化，提示lncRNA GAS5 与心肌纤维化有重要联系。结合本研究中2 型糖尿病CVD 患者血清ln⁃cRNA GAS5 表达降低，推测lncRNA GAS5 影响CVD 发生发展的可能机制之一为：病理因素导致lncRNA GAS5 表达水平下降，lncRNA GAS5 抑制心肌成纤维细胞增殖、分化能力降低，心肌组织损伤及心肌纤维化加重，从而导致或加速CVD 疾病进展。此外，既往研究显示，动脉粥样硬化斑块形成引起的冠状动脉管腔狭窄或闭塞是造成多种CVD 的重要因素，而内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化早期重要的病理特征之一［14⁃15］。Diao 等［16］研究中，诱导心肌微血管内皮细胞损伤后，lncRNA GAS5 水平降低，氧化应激损伤加重。由既往文献及本研究相关性结果，进一步推测lncRNA GAS5 不仅能影响心肌纤维化发展，还有可能通过介导胆固醇运转、脂质聚集以及氧化应激来减轻内皮细胞损伤。而lncRNA GAS5 表达水平降低则能逆转上述过程，刺激内皮细胞，导致内皮细胞功能障碍，加速动脉粥样硬化及CVD 的发生发展。本研究通过ROC 曲线分析，还发现了lncRNA GAS5 预测CVD 的最佳截断值，此截断值下的特异性为0.82%，敏感度为0.75%，预测准确度较高，但此截断值仍需大样本研究进一步优化。此外，本研究结果显示BMI 是2 型糖尿病患者发生CVD 的独立危险因素，lncRNA GAS5 是2 型糖尿病患者发生CVD 的保护因素。提示临床中需密切监测2 型糖尿病患者BMI 及lncRNA GAS5 水平的变化，以防心肌纤维化、肥胖等因素加速CVD 的发生发展。

综上所述，2 型糖尿病患者血清lncRNA GAS5水平降低可能与CVD 风险增加有关，且对CVD 的发生有重要预测作用。鉴于lncRNA GAS5 是心肌细胞增殖、分化的重要调控因子，今后可能成为CVD 的重要治疗靶点之一。然而本研究也有一定的局限性，本研究作为横断面研究，无法完全推断lncRNA GAS5 与2 型糖尿病患者发生CVD 间的因果关系，有待进一步基础研究验证；此外，本研究为单中心的小样本实验，患者选取时难免存在偏倚，无法外推至其他种族人群，尚需多中心、大样本的前瞻性研究进一步验证。