多囊卵巢综合征患者血浆外泌体的差异蛋白质组学分析

王宏锋 张翠莲 谷保霞 王倩 孙莹璞

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是以稀发性排卵或者无排卵、高雄激素血症或胰岛素抵抗、多囊卵巢为特征的内分泌紊乱的症候群［1］。PCOS 是引起育龄女性无排卵性不孕的最常见病因，严重影响着患者的生育状况、生命质量和远期健康［2］。据统计，PCOS 的全球发病率约为6%～10%，呈现逐年升高的趋势［3］。PCOS病因和临床表现的高度异质性导致其临床诊断和治疗方案仍存在诸多争议［4］。外泌体是细胞之间物质与信息交换的载体，在机体的多种病理生理学过程中均扮演着重要的角色［5］。从血浆外泌体角度去研究PCOS 相关的差异蛋白质组，未见相关报道。因此，本研究拟通过Label⁃free 定量蛋白质组学技术对PCOS 患者的血浆外泌体差异蛋白进行分析，为深入研究PCOS 的发病机制提供实验数据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

抽取2017年7月至2018年6月于河南省人民医院就诊的60 例PCOS 患者空腹血浆（PCOS 组）及60 名无PCOS 的健康体检女性空腹血浆（对照组），每例1 mL。每组随机抽取血浆标本各3 例，用于Label⁃free 蛋白质组学实验。每组随机抽取血浆标本30 例，用于ELISA 验证实验。参与本实验的PCOS 患者均为首次确诊病人，且未接受过药物治疗。PCOS 纳入标准：2003年欧洲人类生殖及胚胎协会和美国生殖医学学会制定的多囊卵巢综合征诊断的鹿特丹标准［6］。PCOS 排除标准：①如果泌乳素水平明显升高应排除垂体瘤；②高雄激素血症或明显的高雄激素临床表现，应排除非典型肾上腺皮质增生、柯兴氏综合征、分泌雄激素的卵巢肿瘤等。本研究经院医学伦理学委员会审核及授权，受试者均签署实验知情同意书。

1.2 主要实验仪器及试剂耗材

Optima L⁃100XP 低温超速离心机购自美国的Beckman Coulter 公司；H⁃7650 透射电镜购自日本的Hitachi 公司；EASY⁃nLC 1200 纳升级液相色谱仪和Q⁃Exactive 质谱仪购自美国Thermo Scientific公司。质谱级牛胰蛋白酶（批号：90059）和常用化学试剂购自美国Thermo Scientific 公司；Sep⁃Pak 脱盐柱（批号：WAT020515）购自美国Waters 公司；CD9 抗体（批号：sc⁃18869AC）、CD63 抗体（批号：sc⁃15363）和二抗均购自于美国Santa Cruz 公司；BCA 蛋白定量试剂盒（批号：23225）和肽段定量试剂盒（批号：23275）、人MBL2 ELISA 试剂盒（批号：EHMBL2）购自美国Thermo Scientific 公司；人PZP ELISA 试剂盒（批号：XY⁃PZP⁃Hu）购自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 血浆外泌体的提取与鉴定

采用超速离心法提取和富集血浆外泌体［7］。利用透射电镜检测提取的血浆外泌体囊泡的形状和直径。利用Western blot 检测血浆外泌体标本中特异性标志物蛋白CD9 和CD63 的表达情况。

1.4 血浆外泌体蛋白的裂解

样品与蛋白裂解液（8 M 尿素，1 μg/mL 抑肽素，5 μg/mL 亮抑蛋白酶肽和1 mM PMSF）按照体积比1∶10 加入；冰水混合物中超声破碎2 min；冰上蛋白裂解30 min；将裂解产物4℃，12 000 g 离心30 min（离心半径为6 cm），吸取蛋白上清。

1.5 血浆外泌体蛋白的酶解、肽段纯化及定量

吸取150 μg 血浆外泌体蛋白至酶解管，补充蛋白裂解液至150 μL；加入还原剂TCEP 至终浓度10 mM，37℃水浴反应60 min；加入碘乙酰胺储液至终浓度40 mM，室温下避光反应40 min；加入7倍体积的100 mM TEAB 缓冲液；按照酶与蛋白比例为1∶50 的质量比加入质谱级牛胰蛋白酶，37℃水浴16 h。利用Sep⁃Pak 纯化色谱柱纯化酶解肽段。利用肽段定量试剂盒对纯化后的肽段进行定量。

1.6 Label⁃free 蛋白质组学检测

调整肽段浓度为0.5 μg/μL，进行液相色谱⁃质谱分析。数据采集软件为Thermo Xcalibur 4.0；色谱柱为C18 反相色谱柱（75 μm×25 cm）；色谱总分离时间为180 min；缓冲液A 是2%乙腈，0.1%甲酸；缓冲液B 是80% 乙腈，0.1% 甲酸；流动相流速为300 nL/min；MS 扫描质荷比（m/z）范围为350～1 300；采集模式选择DDA 模式；选择母离子肽段信号中前20 位肽段进行二级质谱分析；一级质谱分辨率为70 000；碎裂方式采用HCD 方式；二级质谱分辨率为17 500；质谱动态排除时间为30 s。差异蛋白筛选的比率（fold change，FC）标准为：FC＞2.0 或者FC＜-2.0，且P＜0.05。

1.7 生物信息学分析和ELISA

利用DAVID 在线数据库对差异蛋白进行GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析。利用STRING 在线数据库对差异蛋白进行蛋白质相互作用分析。选取可能具有相互作用的差异蛋白进行ELISA 验证，实验步骤参考ELISA 试剂盒说明书。

1.8 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件进行统计学分析；计量资料以（）描述，采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆外泌体的鉴定

透射电镜显示，提取的血浆外泌体直径分布范围为30～150 nm，纯度比较高，见图1A。Western blot 结果表明，CD9 与CD63 条带呈现富集趋势，见图1B。

2.2 血浆外泌体的差异蛋白质组学分析

筛选出16个PCOS相关的血浆外泌体差异蛋白，包括4个表达上调和12个表达下调的蛋白。见表1。

表1 PCOS 相关血浆外泌体差异蛋白质Table 1 Differential expressed proteins of plasma exosomes related to PCOS

2.3 差异蛋白点的生物信息学分析

差异蛋白的GO 富集分析显示，如果按照参与的生物学过程聚类，其主要集中在细菌防御反应、补体激活的经典途径、B 细胞激活的正向调控等；如果按照细胞组分聚类，其主要富集在细胞外区域、细胞外空间、循环的免疫球蛋白复合体等；如果按照分子功能聚类，其主要富集在免疫球蛋白受体结合活性、抗原结合功能、蛋白酶结合活性，见图2A。对差异蛋白进行STRING 蛋白质相互作用分析发现，PZP/MBL2/CHFR1/HP 可能存在直接的相互作用，见图2B。KEGG 通路分析结果显示，差异蛋白主要富集在补体和凝血级联反应信号通路。见图3。

图2 PCOS 血浆外泌体差异蛋白的生物信息学分析Figure 2 Bioinformatic analysis of changed proteins in plasma exosomes of PCOS

图3 PCOS 血浆外泌体差异蛋白的KEGG 通路分析Figure 3 KEGG pathway analysis of changed proteins in plasma exosomes of PCOS patients

2.4 ELISA 验证

选取妊娠带蛋白（pregnancy zone protein，PZP）和甘露糖结合凝集素2（mannose binding lec⁃tin 2，MBL2）进行ELISA 验证，结果显示，PCOS 组血浆外泌体中PZP 蛋白浓度（370.9±123.5 ng/mL）高于对照组（128.2±29.9 ng/mL），差异有统计学意义（P＜0.05），见图4A。 PCOS 组血浆外泌体中MBL2 蛋白浓度（8.4±6.1 ng/mL）低于对照组（16.5±3.3 ng/mL），差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4B。

图4 PZP 和MBL2 的ELISA 实验验证Figure 4 ELISA experimental validation of PZP and MBL2

3 讨论

国内外学者对PCOS 的蛋白质组学研究，多采用卵巢组织或者血浆作为研究标本。以卵巢组织作为研究对象可以反映PCOS 的组织学变化，但是无法发现疾病早期的预警性标记物；以血浆作为研究标本，虽然采集方便、无创伤性，但是最大的缺点是血浆高丰度蛋白对低丰度蛋白的干扰较大［8］。PCOS 发病过程中伴随着大量分泌蛋白谱的变化，因此，本研究从血浆外泌体角度去探索PCOS发病机制相关的差异蛋白质组，蛋白谱相对简单，有利于筛选PCOS 发病相关的功能性蛋白质。

差异蛋白的GO 富集聚类分析表明，其主要参与了细菌防御反应、经典的补体激活途径、B 细胞激活的正向调控等生物学过程，推测差异蛋白可能参与了机体对PCOS 的免疫调控过程和代偿性应激反应［9］。差异蛋白的细胞组分聚类分析显示，其主要富集在细胞外区域、细胞外空间、循环的免疫球蛋白复合体等，预测结果也反映了本研究所用的血浆外泌体提取方法是成功的。差异蛋白的分子功能聚类分析表明，其主要富集在免疫球蛋白受体结合活性、抗原结合功能、蛋白酶结合活性等，免疫球蛋白结合活性及抗原结合活性主要与机体的免疫调控过程相关，蛋白酶结合活性可以抑制蛋白酶对机体某些蛋白的降解，推测PCOS 的发病机制可能与机体的免疫功能紊乱密切相关，与国内外的相关研究报道一致［10］。KEGG 通路分析发现差异蛋白主要富集在补体和凝血级联反应信号通路，从另一个侧面反映了机体免疫调控通路在PCOS 发病过程中的重要性。

针对PCOS 差异蛋白的STRING 相互作用分析发现，PZP/MBL2/CHFR1/HP 可能以蛋白质复合体的形式参与PCOS 的发生发展。因此，后续的ELISA 验证实验选取了PZP 和MBL2 进行蛋白表达量验证。PZP 是一种免疫抑制蛋白，在胎盘和免疫细胞中均有表达。有研究报道，PZP 在阿尔茨海默病人的血清中表达升高［11］，在支气管扩张患者的痰液中也表达上调［12］，另外，在炎症性肠病的血清外泌体中也检测到PZP 蛋白的增高，可作为炎症性肠病诊断的标记物［13］。本研究的蛋白质组学和ELISA 实验结果，均发现PZP 在PCOS 的血浆外泌体中表达上调，提示PZP 可能作为免疫抑制蛋白参与了PCOS 的发病过程。MBL2 是一种存在于血清中的C 型凝集素，主要是通过结合病原生物表面的甘露糖等糖基受体发挥调理吞噬作用，或者通过MBL 途径激活补体，在机体的固有免疫应答过程中发挥重要功能［14］。MBL2 基因突变与感染性疾病、自身免疫性疾病、肾脏疾病均有一定的相关性［15］。本研究发现，MBL2 在PCOS 的血浆外泌体中表达下调，与定量蛋白质组学的实验结果趋势一致，推测MBL2 可能通过减少MBL途径的补体激活进而抑制机体的免疫水平，促进PCOS 的病理生理学进展。

综上所述，本研究通过非标记定量蛋白质组学方法筛选出与PCOS 发病相关的差异蛋白质，PZP 和MBL2 有希望成为未来研究PCOS 发病机制的新靶点，但是需要针对性地设计后续的功能学实验进行深入的研究。