羟基喜树碱脂质体多次静脉滴注对Beagle犬的毒性

陈文忠，丘晓丹，肖 杭，庄 翌，程 光

(1.南京绿叶制药有限公司 研发中心，江苏 南京 210061；2.南京医科大学 实验动物中心，江苏 南京 210009)

羟基喜树碱(hydroxycamptothecin，HCPT)为拓扑异构酶Ⅰ特异性抑制剂，是有效的抗肿瘤药物。羟基喜树碱注射液(M-HCPT)已经用于临床，因为存在半衰期较短、靶向性较差的缺点，临床应用时需延长给药时间或延长疗程，导致骨髓抑制和消化道毒性相关的剂量限制性毒性(DLT)也随之增加，从而限制了其临床应用[1-5]。脂质体作为一种新型剂型，可以通过增加羟基喜树碱重要活性基团δ内酯环在水溶液和血液中的稳定性来改善药物的药代动力学特性和体内组织分布，增加其对肿瘤组织的靶向性和缓释性，从而达到增强疗效、降低毒性的目的[6-13]。

本课题组前期已经完成羟基喜树碱脂质体的研制及制备，同时评价了羟基喜树碱脂质体的小鼠体内抗肿瘤药效且取得突破性的进展[14]。本研究依据中国食品药品监督管理局(NMPA)发布的新药非临床药理毒理相关指导原则[11-12]，进行了羟基喜树碱脂质体给予Beagle犬静脉滴注4周的长期毒性试验，观察其毒性反应及其可逆性，发现潜在毒性靶器官，并与市售普通制剂羟基喜树碱注射液的毒性进行比较研究，以期为临床研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器

羟基喜树碱原料药，美尔雅(集团)美升药业有限公司；蛋黄卵磷脂，南京绿叶制药有限公司；胆固醇，南京新百药业有限公司；环磷酰胺(批号：03112721)，江苏省恒瑞医药股份有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯试剂，其他试剂为市售分析纯。

ADVIA 120型全自动血液分析仪，拜耳公司；CA-1500型血凝仪，希森美康医用电子(上海)有限公司；XPAND全自动生化仪，Dade-Behring公司；EasyLyte plus钾钠氯电解分析仪，MEDICA公司；ECG-651心电图仪，上海光电公司；徕卡-2015切片机，德国徕卡公司；TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-III型包埋机、PHY-III型病理组织漂烘仪，常州中威公司；显微镜，尼康仪器(上海)有限公司；Mastersize 2000型激光粒径分析仪，英国MALVERN公司；岛津高效液相色谱仪，日本岛津公司。

1.2 动物

普通级Beagle犬30只，雌雄对半，7～8月龄，体质量7～9 kg，南京新学人科技开发有限公司，合格证号：SCXK(苏)2002-0028。

1.3 方法

1.3.1 羟基喜树碱脂质体的制备及表征

1)羟基喜树碱脂质体的制备。将蛋黄卵磷脂、胆固醇、羟基喜树碱溶于适量无水乙醇中，过0.22 μm滤膜除菌，滤液置茄形瓶中旋转蒸发，减压抽干成膜[13]。将枸橼酸钠、枸橼酸溶于适量质量分数5%葡萄糖注射液，pH 5.0左右过0.22 μm滤膜除菌，再将此溶液加入上述茄形瓶中洗膜，洗膜完全后置于热水浴中孵育20 min，再冷却后进行高压均质处理，并经0.22 μm滤膜过滤除菌。按每瓶含2 mg羟基喜树碱进行分装、冻干、压塞、出箱、轧口，即得羟基喜树碱脂质体。

2)羟基喜树碱脂质体的粒径及分布研究。取一瓶羟基喜树碱脂质体，加5%葡萄糖注射液4 mL振荡溶解，摇匀，取适量样品加入到5%葡萄糖分散溶剂中，用Mastersize2000型激光粒径分析仪进行测定。

3)羟基喜树碱脂质体的含量测定。采用高效液相色谱外标法测定含量，该法准确、灵敏、分离效果好，专属性强，是制剂分析的首选方法。色谱柱为Lichrospher 5- C18，4.6 mm×250 mm，5 μm(江苏汉邦科技有限公司)，流动相为甲醇-水溶液(两者体积为55∶45)，检测波长266 nm，流速1 mL/min，进样量20 μL，理论塔板数≥1 500。精密称取羟基喜树碱对照品适量，用甲醇制成每1 mL中约含100 μg的溶液作为储备液，然后分别取储备液适量，加流动相2 mL并用甲醇稀释制成1 mL中含0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、35.0和50.0 μg羟基喜树碱溶液作为标准溶液，取20 μL进样，记录色谱图，以质量浓度ρ为Y，峰面积A为X，进行线性回归，绘制标准曲线。将样品峰面积带入标准曲线即可测得羟基喜树碱含量。

4)羟基喜树碱脂质体的包封率及载药量测定。精密量取供试品溶液0.2 mL，加入已平衡好的凝胶柱内，用洗脱溶液洗脱。先定量收集15 mL混浊液(脂质体部分)，置于25 mL量瓶中加水至刻度后摇匀，精密量取1 mL置于2 mL量瓶中加甲醇至刻度后摇匀，按照含量测定方法精密量取20 μL，进行液相色谱分析，记录色谱图，测得峰面积(Ae)。

凝胶柱接着用5 mL 33%乙醇、5 mL 66%乙醇和100%乙醇进行梯度洗脱，定量收集25 mL(即未包入脂质体的游离羟基喜树碱部分)，摇匀，按照含量测定方法精密量取20 μL，进行液相色谱分析，记录色谱图，测得峰面积(Af)。

另精密吸取供试品溶液0.2 mL置于10 mL量瓶内，先加2 mL流动相，再用甲醇稀释至刻度后摇匀，照含量测定方法精密量取20 μL，进行液相色谱分析，记录色谱图，测得总峰面积(At)。

按式(1)～(2)计算包封率和回收率。

羟基喜树碱脂质体载药量的计算见式(3)。

(1)

(2)

(3)

1.3.2 剂量选择依据

根据前期荷瘤小鼠药效学结果，羟基喜树碱脂质体1 mg/kg剂量对小鼠移植性肿瘤H22、S180均有明显抑制作用，与溶媒对照组比较，抑瘤率为80%左右。羟基喜树碱脂质体的临床拟用剂量为6 mg/(人·日)，按体质量60 kg计，约相当于0.10 mg/(kg·d)。

综合动物模型有效剂量、临床拟用剂量及毒性预试验结果，设置本研究高、中、低组剂量为1.2、0.6和0.3 mg/kg，约相当于临床拟用剂量的12、6和3倍。

1.3.3 分组与给药

成年Beagle犬30只按照体质量和性别随机分为生理盐水对照组，市售羟基喜树碱注射液对照组，羟基喜树碱脂质体低、中、高剂量实验组，每组6只，雌雄对半。低、中、高剂量实验组分别给药0.3、0.6和1.2 mg/kg的羟基喜树碱脂质体，市售普通制剂对照组给予1.2 mg/kg羟基喜树碱注射液，4.0 mL/kg静脉滴注，给药速度为1 mL/min，每日1次，连续给药2 d停药2 d，共连续滴注4周，共给药14次。停药后继续观察两周。

1.3.4 检测指标

给药期及恢复期每日两次观察动物的临床症状，体质量和摄食量每周称量1次。给药前、给药4周及恢复2周结束时检查动物的体温、心电、尿液和粪便，采集静脉血液进行血生化及血液学检查。

给药结束每组取4只动物，恢复期结束取剩余2只动物安乐死后进行解剖，对肝、肺、肾及脑等脏器进行称质量并计算脏器系数(脏器系数=器官质量(湿质量)/体质量×100%)。

所有脏器采用10%福尔马林溶液室温固定24 h以上，用全自动封闭式组织脱水机对固定的组织进行脱水，采用石蜡包埋机进行包埋，用切片机进行切片，切片厚度为3～5 μm，将组织切片移入40 ℃的恒温热水器中，待组织片完全展开后将其贴附于载玻片上，经组织漂烘仪56～60 ℃烤片30～60 min后，采用苏木素和伊红进行染色(HE染色)和封片后，在显微镜下观察组织病理学变化。同时采集胸骨骨髓制作涂片，瑞氏和姬姆萨氏混合染色后进行骨髓细胞分类计数。

1.3.5 统计分析

所有数据均采用x±s 表示，试验计量数据以方差分析、t-检验进行药物组与对照组之间的差异比较。

2 结果与讨论

2.1 羟基喜树碱脂质体的表征

2.1.1 羟基喜树碱脂质体粒径及分布

经马尔文激光粒度分析仪测定，所得羟基喜树碱脂质体031031、031105及031109这3批平均粒径结果见表1。由表1可知：3个批号的羟基喜树碱脂质体的平均粒径(D50)为0.357～0.406 μm，粒径分布特征值D10、D50和D90的结果相似，说明制备的羟基喜树碱脂质体的重现性好。

表1 羟基喜树碱脂质体粒径及分布Table 1 Particle size and distribution of hydroxycamptothecin liposomes

2.1.2 羟基喜树碱脂质体的含量测定

采用高效液相色谱外标法测定含量，羟基喜树碱对照品以质量浓度(ρ)对主峰面积A进行回归，结果见表2。由表2的数据得ρ= 0.000 009 722A-0.054 72，R=0.999 9，表明羟基喜树碱在0.204～51.0 μg/mL范围内与峰面积呈线性关系。

表2 羟基喜树碱的标准曲线Table 2 Standard curve of hydroxycamptothecin

取3个不同批次031031、031105和031109脂质体供试品，根据主峰峰面积，以外标法计算出羟基喜树碱的质量分别为1.98、1.96 和1.97 mg，质量分数分别为98.9%、98.0%、98.5%，由此得到本方法的最低检测限为0.04 ng。

2.1.3 羟基喜树碱脂质体的包封率及载药量测定

采用凝胶柱法测定羟基喜树碱脂质体的包封率和载药量，结果见表3。由表3可知：3批羟基喜树碱脂质体包封率为93%～95%，包封率较高，重现性好，满足药典对脂质体药物的包载要求。计算载药量为0.75%左右。

表3 羟基喜树碱脂质体包封率及载药量测定结果Table 3 Encapsulation efficiency and drug loading of hydroxycamptothecin liposomes

2.2 羟基喜树碱脂质体对Beagle犬体质量和摄食量的影响

考察羟基喜树碱脂质体经静脉滴注给药(0.3、0.6和1.2 mg/kg)对Beagle犬体质量及摄食量的影响，结果见表4。给药期间，笼旁观察结果：在1.2 mg/kg羟基喜树碱脂质体及同剂量的羟基喜树碱注射液给药后动物陆续出现食欲不佳、粪便稀溏和活动抑制现象，部分动物出现呕吐和便血。在0.6 mg/kg剂量下部分动物出现类似反应，但症状较轻。由表4可知：给药期后两周，与对照组相比，1.2 mg/kg羟基喜树碱脂质体及羟基喜树碱注射液引起动物的体质量和摄食量显著降低(P<0.01)。以上变化与羟基喜树碱脂质体给药治疗相关，但停药后可自行恢复。

表4 羟基喜树碱脂质体对Beagle犬体质量的影响(Mean±SD)Table 4 Effects of hydroxycamptothecin liposomes on the body weight of Beagle dogs (Mean±SD) mg

2.3 羟基喜树碱脂质体对Beagle犬血液学和血生化各项指标的影响

考察羟基喜树碱脂质体注射液经静脉滴注给药(0.3、0.6和1.2 mg/kg)对Beagle犬静脉血液相关指标的影响，结果分别见表5～6。由表5～6可知：与阴性对照组相比，1.2 mg/kg羟基喜树碱脂质体引起动物单核细胞(MONO)和网织红细胞(RETC)显著降低(P<0.01)，0.6 mg/kg脂质体剂量组动物单核细胞(MONO)、网织红细胞(RETIC)百分数、白细胞(WBC)、嗜酸粒细胞(EOS)、未染色大粒细胞(LUC)百分数、淋巴细胞(LYMPH)、嗜碱粒细胞(BASO)等指标明显降低(P<0.05，P<0.01)；血液生化水平方面，1.2 mg/kg羟基喜树碱脂质体引起犬尿素氮(BUN)显著升高(P<0.05)。2周恢复期结束时，以上异常指标均恢复正常。

表5 羟基喜树碱脂质体对Beagle犬血液学的影响(Mean±SD)Table 5 Effects of hydroxycamptothecin liposome on hematology of Beagle dogs(Mean ±SD)

表6 羟基喜树碱脂质体对Beagle犬血清生化BUN指标的影响(Mean ±SD)Table 6 Effects of hydroxycamptothecin liposomes on serum biochemical parameter of BUN in Beagle dogs (Mean ±SD) mmol·L-1

2.4 羟基喜树碱对体温、心电、尿液和粪便指标的影响

考察羟基喜树碱脂质体经静脉滴注给药(0.3、0.6和1.2 mg/kg)对Beagle犬体温、心电、尿液和粪便的影响(数据未显示)。结果发现：与给药前相比，1.2 mg/kg羟基喜树碱脂质体高剂量组和羟基喜树碱注射液组少量动物肉眼可见粪便带血，但2周恢复期结束时已恢复正常。除此之外，各个给药组动物的尿液、体温和心电图参数未见明显异常。

2.5 羟基喜树碱对脏器系数的影响

羟基喜树碱脂质体经静脉滴注给药Beagle犬0.3、0.6和1.2 mg/kg，每日1次，连续给药2 d，停药2 d，连续滴注4周，在28 d给药结束及2周恢复期结束时采集Beagle犬肝、肺、肾和脑进行称质量并计算脏器系数，结果见表7。由表7可知：与阴性对照组相比，1.2 mg/kg和0.6 mg/kg羟基喜树碱脂质体组动物肝脏器系数降低及脑脏器系数增加(P<0.01)；1.2 mg/kg 脂质体剂量组引起肾脏器系数增加(P<0.05)。1.2 mg/kg注射液组动物肺、脑脏器系数增加(P<0.05，P<0.01)。以上变化在停药两周后逐渐恢复至正常水平。

表7 羟基喜树碱脂质体对Beagle犬主要脏器系数的影响(Mean±SD)Table 7 Effects of hydroxycamptothecin liposomes on main organ coefficient of Beagle dogs(Mean ±SD) %

2.6 对骨髓细胞的影响

羟基喜树碱脂质体经静脉滴注给予Beagle犬0.3、0.6和1.2 mg/kg，每日1次，连续给药2 d，停药2 d，连续滴注4周，在28 d给药结束时，采集Beagle犬胸骨骨髓制作涂片，进行骨髓细胞分类计数，结果见表8。由表8可知：与阴性对照组相比，羟基喜树碱脂质体各给药组酸碱粒细胞比值明显下降(P<0.05，P<0.01)，1.2 mg/kg组成熟粒细胞比值明显降低(P<0.05)。2周恢复期结束，以上异常指标均恢复正常。由此可说明，该药物对红细胞和粒细胞有明显且可逆的抑制作用。

表8 羟基喜树碱脂质体对Beagle犬骨髓细胞的影响(Mean±SD)Table 8 Effects of hydroxycamptothecin liposomes on bone marrow cells of Beagle dogs(Mean±SD) %

2.7 大体病理及组织病理检查结果

羟基喜树碱脂质体经静脉滴注给药(0.3、0.6和1.2 mg/kg)，每日1次，连续给药2 d，停药2 d，连续滴注4周，在28 d给药结束时，对犬剖检后对所有组织进行肉眼观察发现羟基喜树碱脂质体0.6、1.2 mg/kg剂量组以及市售注射液对照组动物的十二指肠、回肠及直肠黏膜面见轻度充血及少量点状出血。除此之外，未发现其他明显异常改变。市售羟基喜树碱注射液对照组给药中期死亡1只动物，解剖可见十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和脾脏有不同程度的出血，推测消化道出血可能是诱发动物死亡的主要原因。

利用组织病理检查来考察羟基喜树碱脂质体对睾丸、大肠、胸骨、给药部位(皮肤)、垂体是否有损伤作用，结果分别见图1～4。

由图1可知：市售羟基喜树碱注射液1.2 mg/kg高剂量组，少部分曲细精管初级、次级和精子细胞变性、坏死，核结构消失；羟基喜树碱脂质体1.2 mg/kg高剂量组，大部分曲细精管生精细胞变性、坏死，核结构消失。

图1 睾丸病理组织切片图(HE×100)Fig.1 Histological changes of testis in Beagle dogs(HE×100)

由图2 可知：市售羟基喜树碱注射液1.2 mg/kg高剂量组，大肠上皮坏死，局部肉芽形成，残存少量的黏膜腺；羟基喜树碱脂质体1.2 mg/kg高剂量组，肠上皮变性，肠腺扩张。

图2 大肠病理组织切片图(HE×100)Fig.2 Histological changes of large intestine in Beagle dogs(HE×100)

由图3可知：胸骨骨髓白细胞均减少，市售羟基喜树碱注射液1.2 mg/kg高剂量组的骨髓白细胞明显减少；羟基喜树碱脂质体1.2 mg/kg高剂量组的骨髓白细胞明显减少。

图3 胸骨病理组织切片图(HE×100)Fig.3 Histological changes of sternum in Beagle dogs(HE×100)

由图4可知：市售羟基喜树注射液碱1.2 mg/kg高剂量组，腺垂体细胞稀疏，嗜碱细胞和显色细胞明显减少；羟基喜树碱脂质体1.2 mg/kg高剂量组，腺垂体细胞稀疏，嗜碱细胞和嫌色细胞明显减少。由此可知，羟基喜树碱脂质体对以上器官的毒性与市售羟基喜树碱注射液的毒性表现及程度基本一致，羟基喜树碱脂质体对睾丸的毒性作用强于羟基喜树碱注射液，其他器官未见明显的毒性作用。2周恢复期结束，所有动物各脏器异常均可恢复至正常水平。

图4 腺垂体病理组织切片图(HE×100)Fig.4 Histological changes of adenohypophysis in Beagle dogs(HE×100)

本研究通过对Beagle犬4周静脉滴注羟基喜树碱脂质体的长期毒性试验，得出如下结论：注射用羟基喜树碱脂质体有明显的消化道毒性反应，主要表现为消化道出血、食欲不振、呕吐或干呕、流涎、摄食减少、体质量减轻、稀便腹泻，同时可见明显的活动减少和萎靡表现。血液学和骨髓检查提示该药物对红细胞和粒细胞有明显的抑制作用，说明对造血系统有影响。另外，血清生化学检查显示该药物对肾脏有轻度影响。病理组织学检查显示其对给药部位(皮肤)、垂体、大肠、胸骨、睾丸有一定损伤作用。但以上所有毒性表现均可逆，停药两周即可恢复或正在恢复，前期的毒代动力学研究发现，在0.3～1.2 mg/kg剂量下连续静脉给予Beagle犬4周，羟基喜树碱脂质体在犬血液中未见明显蓄积现象，充分证实了该药物的毒性反应大多可逆，停药后恢复较快。

3 结论

利用脂质体递送技术将羟基喜树碱包裹成脂质体，毒性研究结果显示：羟基喜树碱脂质体不产生新的严重毒副反应，毒性靶器官主要为消化道和睾丸，但毒性可逆，停药即可恢复；同等剂量的羟基喜树碱脂质体和市售羟基喜树碱注射液毒性表现及程度相当；羟基喜树碱脂质体对犬的无毒性剂量大约为0.3 mg/kg，与市售羟基喜树碱注射液相比具有更大的治疗效果。这与羟基喜树碱脂质体良好的生物相容性以及脂质体载体药物在体内作为储库不断缓慢释放药物、延长药物半衰期具有密切关系，值得进行深入研究。