UHPLC-MS／MS 法测定坤宝丸中麦冬及其掺伪品的4 种特征成分

周恒曹依敏陈铭兰岚孙健毛秀红季申

（上海市食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室，上海201203）

坤宝丸是由酒女贞子、覆盆子、麦冬等23 味药材组成的中药复方制剂，具有滋补肝肾、镇静安神等功效，临床上对妇女绝经前后及更年期综合征有较好的疗效［1-4］。麦冬是坤宝丸主要药味，但山麦冬性状与其相似，导致长期以来在中药材市场上存在山麦冬代替麦冬的现象。文献［5-11］报道，甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 等高异黄酮是麦冬特征成分，而山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C 分别是山麦冬2 个基原药材湖北麦冬、短葶山麦冬特征成分，上述化合物均可作为检测指标用于区分麦冬和山麦冬，近几年来也逐步应用于含麦冬制剂中山麦冬掺伪的筛查［12-13］。

由于麦冬处方量在坤宝丸中不足2%，故需要建立灵敏准确的方法对该药材及其掺伪品山麦冬进行分析，但传统的TLC 法、HPLC-ELDS 法由于灵敏度不足，专属性不强，均无法满足检测要求［14-15］。因此，本实验采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（UHPLC-MS／MS）法测定坤宝丸中麦冬及其掺伪品中甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C 这4 种特征成分的含量，以期实现对该制剂中正品麦冬的质量控制，也可对制剂中是否存在山麦冬掺伪麦冬投料进行准确判断。

1 材料

Agilent 1290 型超高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Triple Quad 6500 型三重四极杆串联质谱仪，配置MultiQuant 数据处理软件、电喷雾源（美国AB SCIEX 公司）；BP211D、CP224S 型电子分析天平（德国Sartorius 公司）；Centrifuge 5810R 型离心机（德国Eppendorf 公司）；Mikro 200R 型高速冷冻离心机（德国Hettich 公司）；Elmasonic E300H 型超声波清洗仪（德国Elma 公司）；Milli-Q 型超纯水系统（美国Milipore 公司）；Multivap 113型氮气吹干仪（美国Organomation 公司）。甲基麦冬黄烷酮A（批 号Z11N8X48156）、甲基麦冬黄烷酮B（批 号Y25A10L86868）对照品均购自上海源叶生物科技有限公司；山麦冬皂苷B（批号111907-201001）、短葶山麦冬皂苷C（批号111908-201001）对照品均购自中国食品药品检定研究院。坤宝丸共179批，均为市售品，具体信息见表1。色谱纯甲醇、乙腈（德国Merck 公司）；色谱纯甲酸（美国Fisher Scientific 公司）。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度 洗脱，程序见表2；体积流量0.4 mL／min；柱温35 ℃；进样量5 μL。

表2 梯度洗脱程序

2.2 质谱条件 电喷雾（ESI）离子源，正负离子扫描；多反应监测（MRM）模式；电喷雾电压5 500 V（正离子）、-4 500 V（负离子）；离子源温度500 ℃；气帘气（CUR）20.0 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；碰撞气（CAD）7.0 psi；雾化气（氮气）50.0 psi；辅助气50.0 psi；射入电压（EP）10 V；射出电压（CXP）15 V。其他参数见表3。

表3 各成分质谱参数

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液 精密称取各对照品，70%甲醇制成每1 mL 含山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 各1 mg 的贮备液，精密量取适量，70%甲醇定容至100 mL，制成1 000 ng／mL 溶液，依次稀释至5、10、50、100、200、400 ng／mL，即得，在4 ℃下保存。

2.3.2 供试品溶液 精密称取本品粉末0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入70% 甲醇25 mL，称定质量，超声（250 W、40 kHz）处理120 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，4 000 r／min 离心5 min，取上清液1 mL，14 000 r／min 离心5 min，取上清液，即得。

2.3.3 阴性样品溶液 按处方配比，制得缺麦冬的阴性样品，按“2.3.2”项下方法制备，即得。

2.4 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，结果见图1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分MRM 离子流图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密吸取“2.3.2”项下不同质量浓度对照品溶液各5 μL，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表4，可知各成分在5～400 ng／mL范围内线性关系良好。

表4 各成分线性关系

2.5.2 精密度试验 精密吸取50 ng／mL 对照品溶液5 μL，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定6次，测得山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 峰面积RSD 分别为2.8%、2.6%、2.2%、1.9%，表明仪器精密度较好。

2.5.3 重复性试验 取本品（85 号）粉末0.5 g，按“2.3.2”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷含量RSD 分别为4.2%、3.6%；取本品（10 号）粉末0.5 g，按“2.3.2”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 含量RSD 分别为5.1%、3.8%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验 精密称取阴性样品0.5 g，共9份，置于具塞锥形瓶中，加入低、中、高水平（2.5、5、10 μg／g）对照品溶液，每个水平3份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，计算回收率。结果，山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 平均加样回收率分别为108.6%、105.0%、91.2%、91.3%，RSD 分别为4.5%、4.0%、4.6%、4.5%。

2.5.5 基质效应试验 取阴性样品0.5 g，共6份，按

“2.3.2”项下方法处理，氮吹仪上40 ℃水浴浓缩至约0.4 mL，分别加入100 ng／mL 对照品溶液50、100 μL，1 000 ng／mL 对照品溶液50、100、200、400 μL，70%甲醇定容至1 mL，涡旋混匀，14 000 r／min 离心5 min，取上清液，即得基质对照品溶液（5、10、50、100、200、400 ng／mL），分别精密吸取5 μL，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，按“2.4.1”项下方法进行回归，计算斜率，测定基质效应，公式为基质效应＝ ［（基质匹配回归方程斜率／溶剂回归方程斜率）-1］×100%。结果，山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 基质效应分别为-2%、4%、12%、11%，均不明显［16-17］，表明可采用溶剂回归方程代替基质匹配回归方程来进行定量分析。

2.5.6 检出限考察 检出限以基质对照品溶液的最低浓度值（LCL）为标准进行计算，测得山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 检出限均为0.25 μg／g。

2.6 样品含量测定 取179 批样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，每批2份，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，计算含量，结果见表5。由此可知，53 批检出山麦冬皂苷B，58 批检出短葶山麦冬皂苷C，8 批同时检出山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C，其余60 批仅检出甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B。另外，在检出山麦冬皂苷B 或短葶山麦冬皂苷C 的119 批样品中，有8 批也同时检出甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B。

表5 各成分含量测定结果（μg／g）

3 讨论

3.1 麦冬特征成分选择 谈梦霞等［9］通过PLS-DA 发现，与山麦冬比较，麦冬中赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、麦冬皂苷D、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 含量较高，可作为两者差异成分；本实验发现，与甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 比较，相同质量浓度的麦冬皂苷D 对照品溶液在质谱中的响应要低100～300倍，而且在麦冬、山麦冬中的含量差异也更小，故以麦冬皂苷D 为麦冬特征成分可能会造成误判。另外，坤宝丸药味复杂，赖氨酸、精氨酸、缬氨酸等氨基酸的专属性较差，也无法用于麦冬、山麦冬的区分鉴定，故最终选择甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 作为麦冬特征成分。

3.2 结果分析 179 批坤宝丸中有119 批检出山麦冬特征成分，占总量的66.5%，表明麦冬与山麦冬混用现象较为普遍，但2015 年版《中国药典》 暂未对坤宝丸中麦冬成分设置质控项目，相关标准有待修订完善。文献［6］报道，湖北麦冬中山麦冬皂苷B 含量为80～150 μg／g，而其须根中该成分含量达1 090～2 830 μg／g。假设坤宝丸完全使用湖北麦冬投料，以处方量占比2%计算，则山麦冬皂苷B 含量应大致为1.6～3.0 μg／g，但本实验发现部分样品中该成分实际含量明显超出了这一范围，推测可能存在湖北麦冬须根投料的情况，需引起关注。

4 结论

本实验建立UHPLC-MS／MS 法测定坤宝丸中麦冬及其掺伪品的4 种特征成分含量，该方法样品前处理快速简便，检测灵敏度较高，准确度良好，可为该制剂质量控制提供可靠的分析手段和参考依据。