化痰活血降气方对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能和炎症因子的影响

余 宁，周新燕，张 念，余 丹，杨 硕，叶树鸣

(武汉市中西医结合医院，湖北 武汉 430022)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种常见的以气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，其气流受限多呈进行性发展，与气道和肺组织对烟草烟雾等有害气体或有害颗粒的慢性炎性反应有关[1]，其发病以炎症机制为核心，有多种因素的介入包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、内皮素1(endothelin 1，ET-1)等炎症因子和转录激活因子4(STAT4)和STAT6，引起气道、肺实质与肺血管的炎症反应及结构重塑，导致肺组织的损伤[2-4]。

中医药在治疗COPD方面具有独特的优势，本团队前期实验研究发现，慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者，以化痰活血降气法治疗，可以降低气道局部和全身的炎症相关细胞因子水平，减轻呼吸道局部和全身的炎症反应水平，取得良好的临床疗效[5]，现通过观察气管内滴注LPS联合烟熏COPD模型大鼠肺组织病理形态学、肺功能、肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、ET-1的水平和肺组织中STAT4、STAT6蛋白表达，进一步探讨化痰活血降气法治疗慢性阻塞性肺疾病的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级雄性Wistar大鼠36只，体质量200～220 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCKX(京)2016-0002。

1.2 药物 化痰活血降气方颗粒剂由丹参(批号 18080028)30 g、赤芍(批号18040038)10 g、桃仁(批号18060087)10 g、杏仁(批号 18060087)10 g、苏子(批号18080061)10 g、款冬花(批号18020095)10 g、瓜蒌皮(批号18050010)10 g、浙贝母(批号 18040054)10 g、黄芩(批号18030117)10 g、鱼腥草(批号 17100130)30 g、苦参(批号18020100)10 g、麻黄(批号17050111)10 g组成，四川新绿色药业科技发展股份有限公司生产。醋酸泼尼松片(华中药业股份有限公司，批号20180505)。

1.3 试剂 大鼠TNF-α、IL-1β、ET-1酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司(批号L-2880)；兔多克隆抗体GAPDH购自杭州贤至生物科技有限公司(货号AB-P-R001)；兔多克隆抗体STAT4(货号51070-2-AP)、兔多克隆抗体STAT6(货号51073-1-AP)均购自武汉三鹰生物技术有限公司；黄鹤楼牌香烟购自甘肃烟草工业有限责任公司。

1.4 仪器 AniRes动物肺功能仪(北京贝兰博科技有限公司)；ICV-450型电热恒温培养箱(日本ASONE公司)；FlexStation 3型多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；电转仪(北京六一仪器厂)；T8-1型磁力搅拌器(江苏省金坛市中大仪器厂)。

2 方法

2.1 COPD模型制备 参照文献[6]方法加以改良后，采用气管内滴注LPS加烟熏法建立COPD大鼠模型，分别于第1、14天往大鼠气管内滴注LPS(0.1 mg/100 g)，第2～13、15～28天，每天上午将大鼠放置在48 L玻璃密闭箱内，持续熏黄鹤楼牌香烟雾30 min，每只大鼠使用1支，每天1次。

2.2 分组及给药 36只健康雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、阳性对照组及化痰活血降气方高、中、低剂量组，每组6只。空白组大鼠不予任何处理，其余各组均建立COPD模型。化痰活血降气方临床常规用量160 g/d(按生药计)，醋酸泼尼松片临床常规用量50 mg/d，按照人与动物体表面积换算法计算[7]，造模成功后按28.8、14.4、7.2 g/kg生药剂量分别给高、中、低剂量组大鼠灌胃化痰活血降气方，阳性对照组给予灌胃醋酸泼尼松片剂量为4.5 mg/kg，正常组和模型组灌胃给予等容量蒸馏水，持续给药28 d。

2.3 大鼠肺功能的检测 灌胃给药结束后用AniRes动物肺功能分析系统检测大鼠的肺功能指标包括0.3 s用力呼气容积(FEV0.3)、0.3 s用力呼气容积与用力肺活量比值百分数(FEV0.3/FVC)、呼气流量峰值(PEF)。

2.4 肺组织与病理形态学观察 大鼠处死后，结扎未灌洗的左肺取肺组织，经脱水、透明、石蜡包埋，蜡块4 μm切片后脱蜡水化，进行苏木素-伊红(HE)染色，透明后中性树胶封片，100倍及200倍光镜观察。

2.5 ELISA法检测大鼠肺泡灌洗液中细胞因子TNF-α、IL-1β、ET-1水平 收集大鼠肺泡灌洗液(BALF)，3 000 r/min离心10 min，取各组大鼠BALF上清液按照ELISA试剂盒说明操作，计算TNF-α、IL-1β、ET-1水平。

2.6 Western blot法检测大鼠肺组织中STAT4、STAT6蛋白表达 将少量剪碎的组织置于2 mL EP管中，充分裂解30 min后，在4 ℃下12 000 r/min离心5 min，取上清液保存。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，取蛋白样本凝胶电泳、转膜，用5%脱脂奶粉封闭,加入一抗GAPDH(1∶1 000)、STAT4(1∶1 000)、STAT6(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。洗涤5次，加入二抗(1∶50 000)37 ℃孵育2 h，TBST洗涤5次，ECL试剂显色曝光,用BandScan分析灰度值。

2.7 免疫组化法检测大鼠肺组织STAT4、STAT6蛋白表达 各组大鼠肺组织经脱水透明、浸蜡包埋、脱蜡、抗原修复后，添加3%过氧化氢室温孵育15 min，洗涤3次后加血清室温封闭30 min，甩干后加一抗(稀释比例为1∶100)4 ℃孵育15 h，PBS冲洗3次后加酶标二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗4次滴加DAB显色液，苏木素复染后PBS浸洗返蓝，脱水分片镜检，棕黄色或棕褐色为目标蛋白。观察每张切片4个高倍视野(×400)，通过图像分析软件Image J软件分析每个视野的平均光密度(MOD)值，取平均值，整理数据并统计分析。

3 结果

3.1 化痰活血降气方对大鼠肺组织病理学的影响 空白组大鼠支气管结构基本完整，肺血管壁未见明显增厚，肺泡结构基本完整，少量散在的炎性细胞浸润；模型组大鼠气管上皮细胞脱落，杯状细胞增生，管腔内可见分泌物，大量炎性细胞浸润，肺血管壁增厚，肺泡间隔变窄并断裂，融合成较大的囊腔；阳性对照组大鼠支气管结构的破坏、炎性细胞的浸润、肺泡间的融合均较前改善，但肺血管壁仍可见明显增厚；化痰活血降气方高剂量组大鼠支气管上皮细胞的破坏较模型组减轻，血管壁增厚不明显，炎性细胞的浸润及肺泡融合扩张明显减轻，与阳性对照组相当，中剂量组肺组织病理变化较模型组稍有减轻，低剂量组病理学变化接近模型组。见图1。

图1 各组大鼠肺组织HE染色图(×100)

3.2 化痰活血降气方对大鼠肺功能的影响 与空白组比较，模型组大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF水平均降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组及化痰活血降气方各剂量组大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF水平均升高(P<0.01)，且呈剂量依赖性；与阳性对照组比较，化痰活血降气方高剂量组FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF水平无无明显变化(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肺功能

3.3 化痰活血降气方对大鼠BLAF中TNF-α、IL-1β、ET-1水平的影响 与空白组比较，模型组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、ET-1水平均升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组及化痰活血降气方低剂量组大鼠BLAF中TNF-α、IL-1β、ET-1水平均降低(P<0.05，P<0.01)，且呈剂量依赖性。各组间比较，以化痰活血降气方高剂量组疗效最优，其降低TNF-α、ET-1水平作用与阳性对照组相当。见表2。

表2 各组大鼠肺泡灌洗液中细胞因子水平

3.4 化痰活血降气方对大鼠肺组织中的STAT4、STAT6蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠肺组织中STAT4、STAT6表达均升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组及化痰活血降气方各剂量组STAT4、STAT6表达均降低(P<0.05，P<0.01)，且呈剂量依赖性。各组间比较，以化痰活血降气方高剂量组疗效最优，与阳性对照组相当。见表3、图2。

表3 各组大鼠肺组织中STAT4、STAT6蛋白表达(±s，n=6)

注：A为空白组，B为模型组，C为阳性对照组，D～F为化痰活血降气方高、中、低剂量组。图2 各组大鼠肺组织中STAT4、STAT6蛋白表达

3.5 化痰活血降气方对大鼠肺组织中STAT4、STAT6表达的影响 免疫组化染色后STAT4、STAT6阳性表达在镜下表现为棕黄色颗粒。与空白组比较，模型组大鼠肺组织中STAT4、STAT6表达均升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组及化痰活血降气方各剂量组STAT4、STAT6表达均降低(P<0.01)，且呈剂量依赖性。见表4、图3～4。

表4 各组大鼠肺组织中STAT4、STAT6表达

图3 各组大鼠肺组织中STAT4表达(免疫组化，×400)

图4 各组大鼠肺组织中STAT6表达(免疫组化，×400)

4 讨论

COPD属中医“喘病”“肺胀”等病，中医认为“痰”“瘀”是其关键病理因素，痰瘀阻肺，肺气不降始终是本病的主要病机，化痰活血降气方以赤芍、桃仁、丹参活血化瘀；杏仁、苏子利肺降气；炙麻黄宣肺平喘；款冬花降气化痰；全瓜蒌、浙贝母、黄芩、鱼腥草、苦参清热化痰，该方化痰、活血、降气三法并施，使本病尽快进入缓解期，促进正气的恢复，改善体质，减少再次发作，在前期临床观察证实疗效显著，现通过大鼠实验研究探讨其作用机制。

COPD模型组大鼠肺组织病理切片可见气道黏膜上皮细胞破坏，杯状细胞增生，大量炎性细胞浸润，肺泡间隔变窄并断裂，血管壁增厚，符合COPD的病理学特点，提示气管内滴注LPS联合烟熏法COPD建模成功。与模型组比较，化痰活血降气方高剂量组炎性细胞的浸润及肺泡融合扩张明显减轻，中剂量组肺组织炎性改变也有所减轻，并且高剂量组的抗炎作用与醋酸泼尼松相当，佐证了化痰活血降气方可以通过抗炎和减轻肺组织重构治疗COPD。

肺功能检查是诊断COPD的金标准[8]，FEV1和FEV1/FVC是提示气流受限和COPD严重程度的敏感指标，PEF能够反映气道阻塞程度，因大鼠的呼吸频率比人快，所以选用 FEV0.3/FVC来代替 FEV1/FVC[9]。本研究结果显示，模型组大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF较空白组降低，客观指标提示气管内滴注LPS联合烟熏法COPD建模成功，经化痰活血降气方治疗后都有不同程度的回升，其中以高剂量组的疗效最优，与醋酸泼尼松疗效相当，所以化痰活血降气方可以改善肺功能，减轻气道阻塞。

炎症细胞参与了慢性阻塞性肺病的病理过程，释放多种炎性介质，诱导损伤和修复的反复循环[10]。其中TNF-α是单核-巨噬细胞所形成的单核因子，是在细胞炎症反应中起关键作用的巨噬细胞核转录因子κB(NF-κB)的有效激活剂[11]，并且能够诱导中性粒细胞释放蛋白水解酶破坏肺血管内皮和肺泡上皮[12]。IL-1β也是COPD的主要促炎因子，可促进中性粒细胞在气道周围募集，不断加重炎症反应，并且引起支气管黏膜水肿，腺体分泌增多，加重气道阻塞，使气流受限进一步恶化[13-14]。ET-1是由内皮细胞分泌的内源性血管收缩剂[15]，有促进细胞增殖的作用，引起血管壁增厚及管狭窄，血管收缩和细胞增殖导致血管重塑[16]，同时ET-1参与NF-κB的激活及其他促炎细胞因子(包括TNF-α)的表达[17]。本研究结果显示，模型组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、ET-1炎症因子较空白组均升高，经化痰活血降气方治疗后都有不同程度的降低，其中以高剂量组的疗效最优，与醋酸泼尼松疗效相当，所以化痰活血降气方可通过降低肺组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、ET-1的水平来减轻肺组织的炎症反应，并且ET-1水平降低可以减轻肺血管重塑，IL-1β水平的降低可以缓解支气管粘膜水肿，减轻气道阻塞，阻止COPD病情加重。

近年来相关研究表明Th1/Th2功能平衡在肺部疾病中起关键作用[18]，Th1细胞和Th2细胞可通过分泌相关的因子，引发机体的一系列促炎与抗炎反应。Th1细胞主要分泌INF-γ等炎症因子，INF-γ激活中性粒细胞引起肺部炎症反应，其转录因子STAT4蛋白能够诱导Th0向Th1分化，并且具有促炎作用[19-20]。Th2细胞分泌IL-4等抑炎因子，可引起免疫细胞对机体产生保护，减轻肺部炎症，并且能够抑制Th1细胞增殖作用，其转录因子STAT6蛋白能诱导Th0向Th2的分化，具有免疫调节和抑炎作用[19-21]。本研究结果显示，模型组大鼠STAT4蛋白表达升高，STAT6蛋白表达降低，经化瘀活血降气方治疗后，STAT4蛋白表达有不同程度降低，STAT6蛋白表达有不同程度的提升，均以化痰活血降方高剂量组为最优，其作用与醋酸泼尼松片相当。所以化痰活血降气方可以通过抑制STAT4蛋白表达使Th0向Th1细胞分化减弱，减少INF-γ等促炎因子的分泌，减轻肺部炎症反应；同时促进STAT6蛋白表达，加强Th0向Th2细胞分化，增加IL-4等抑炎因子的分泌，有助于Th1/Th2恢复平衡，达到治疗慢性阻塞性肺疾病的作用。

综上所述，化痰活血降气方可通过降低BLAF中TNF-α、IL-1β、ET-1等炎症因子水平，抑制STAT4蛋白表达，促进STAT6蛋白表达，从而有助于Th1/Th2恢复平衡，抑制气道炎症反应、修复肺泡间的融合、缓解血管壁增厚，改善COPD大鼠肺组织的炎症反应，证实化痰活血降气方确能有效抑制COPD的炎症反应，阻止病情加重。