葛根素对多囊卵巢综合症大鼠糖代谢及TLR4/NF-κB信号通路的影响

董 敏，徐 敏，陈一源

(遵义医科大学附属医院妇产科，贵州 遵义 563000)

多囊卵巢综合症是(polycystic ovary syndrome,PCOS)育龄女性常见的排卵障碍，50%的PCOS患者同时伴有不孕，是一种复杂的多基因疾病，且会受到遗传和环境的影响，包括生活方式、饮食等。PCOS发病可能与下丘脑-垂体-卵巢轴紊乱、高雄激素血症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、肥胖甚至是机体炎症相关[1]。有中医学者认为PCOS的病机主要是来自于脾肾亏虚，肝经郁火、脾肾两虚会导致痰血、痰湿，因此肝气郁结、脾肾亏虚是PCOS之本，痰血、痰湿是本病之标，痰血、痰湿日久可能引起浊毒[2-3]。也有学者认为肾虚所导致的气血失调，使卵子不能排出、卵巢增大，同时肾虚会引起痰血、痰湿，导致胰岛素抵抗、高雄激素血症等内分泌紊乱，同时引起患者肥胖、月经不调，严重者不孕[4]。近来有文献表明葛根素在对抗高雄激素、脂代谢异常、胰岛素抵抗、氧化应激方面有较好疗效[5]，但其机制尚不明确。Guo等[6]发现调节Toll样受体4(TLR4)使TLR4/NF-κB信号通路下调，可以抑制PCOS大鼠炎症反应，从而改善PCOS大鼠的胰岛素抵抗。郭亚东等[7]发现葛根素可以下调肥胖型高血压患者血管内皮细胞的TLR4/NF-κB信号，从而保护血管内皮。本文旨在探讨葛根素对PCOS模型大鼠糖代谢的影响，同时对TLR4/NF-κB信号通路是否参与葛根素对PCOS的治疗进行研究。

1 材料与方法

1.1 动物 100只健康雌性SD大鼠，7周龄，210～230 g，购自中国科学院上海实验动物中心，将大鼠饲养于清洁级动物房，实验动物使用许可证号SYXK(沪)2019-0003。

1.2 试剂与药物 脱氢表雄酮(DHEA)(美国Sigma公司，批号709549)；盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司，批号1210010)；葛根素注射液(成都平原药业有限公司，国药准字H20054815，批号111034-201901)。大鼠血清中促黄体生成素(LH)ELISA试剂盒(货号Q69170)、睾酮(T)ELISA试剂盒(货号Q06415)、卵泡刺激素(FSH)ELISA试剂盒(货号Q60687)(美国R&D公司)；白细胞介素6(IL-6)ELISA试剂盒(货号ab2018113)、C反应蛋白(CRP)ELISA试剂盒(货号ab256398)、肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA试剂盒(货号ab46070)、HE染色试剂盒(货号ab143166)(英国Abcam公司)；葡萄糖检测试剂盒(上海浩然生物科技有限公司，批号910202)；RT-qPCR试剂盒(日本TaKaRa公司，AK3001)；Trizol(美国Invitrogen公司，批号10296028)。

1.3 仪器 冷动离心机(美国Thermo公司)；Gel Doc 2000型凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)；PCR仪(德国Biometra公司)；光学显微镜(德国Leica公司)；酶标仪(美国BioTek公司)。

1.4 模型建立 取80只大鼠根据文献[8]方法进行PCOS模型构建。配制0.6 g/kg的DHEA，每次注射前用0.2 mL大豆油稀释后注射于大鼠颈背部皮下，每天1次。20 d后，取大鼠1个动情周期(一般连续4 d)的阴道涂片，于光学显微镜下观察，若观察到阴道上皮在此周期内持续大量角化且无核视为模型构建成功。

1.5 PCOS模型大鼠分组及干预 将最终建模成功的60只大鼠，随机分为模型组、二甲双胍组、二甲双胍+葛根素组，每组20只。根据人鼠药物剂量换算出大鼠所需药量。二甲双胍组灌胃给予二甲双胍粉末(270 mg/kg)，每次灌胃前用生理盐水溶解；二甲双胍+葛根素组在二甲双胍组基础上腹腔注射100 mg/kg葛根素注射液；模型组腹腔注射等容量生理盐水，连续给药4周，即7个动情周期[5]，另选取20只未造模大鼠作为对照组。

1.6 监测指标 给药4周后，禁食24 h，记录大鼠体质量，异氟烷气体吸入麻醉大鼠后，取腹主动脉血，离心后取血清。葡萄糖试剂盒检测大鼠空腹血糖(FBG)，放射免疫法测量空腹胰岛素(FINS)，并计算胰岛素抵抗指数值(IR)[8]，公式为IR=(FBG× FINS)/22.5。第1次取血后立即灌胃给予葡萄糖，2 h后抽取尾静脉血，检测餐后2 h血糖(2 h PBG)。按ELISA试剂盒检测大鼠血清中LH、T、FSH、IL-6、CRP和TNF-α水平。此外，取大鼠卵巢组织，去掉表面脂肪组织后，用4%多聚甲醛固定，乙醇逐级脱水，用石蜡进行包埋，切片厚度5 μm，最后进行HE染色，并置于显微镜下观察组织形态。

1.7 RT-qPCR检测TLR4、NF-κB及ox-LDL的mRNA表达 使用Trizol试剂盒提取卵巢组织匀浆中的总RNA，鉴定纯度和完整性。用Primer 5.0软件设计引物，见表1，按试剂盒说明书逆转录合成cDNA，并进行PCR扩增，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，40个循环。扩增完成后进行2%琼脂糖凝胶电泳40 min，用Gel Doc 2000型凝胶电泳进行成像和分析。GAPDH作为内参，根据灰度值计算mRNA相对表达量。

表1 大鼠TLR4、NF-κB及ox-LDL引物序列Tab.1 Primer sequences of TLR4,NF-κB and ox-LDL in rats

2 结果

2.1 葛根素对PCOS大鼠体质量的影响 如表2所示，模型组大鼠体质量高于对照组(P<0.05)；二甲双胍组和二甲双胍联合葛根素组体质量低于模型组(P<0.05)，且和对照组大鼠比较无显著差异(P>0.05)；二甲双胍组和二甲双胍联合葛根素组大鼠体质量比较无显著差异(P>0.05)。

表2 各组大鼠体质量Tab.2 Body weights of rats in each

2.2 葛根素对PCOS大鼠血清性激素水平的影响 如表3所示，与对照组比较，模型组和二甲双胍组大鼠FSH降低(P<0.05)，LH、T水平升高(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组和二甲双胍+葛根素组大鼠FSH水平均升高(P<0.05)，LH、T水平均降低(P<0.05)，且二甲双胍+葛根素组大鼠作用更显著(P<0.05)。

表3 各组大鼠血清性激素水平Tab.3 Serum levels of sex hormones of rats in each

2.3 葛根素对PCOS大鼠血糖水平和胰岛素抵抗的影响 如表4所示，模型组大鼠FBG、2 h PBG、FINS水平及IR均高于对照组(P<0.05)；二甲双胍组和二甲双胍+葛根素组大鼠FBG、2 h PBG、FINS水平及IR均低于模型组(P<0.05)；二甲双胍+葛根素组FINS水平和IR低于二甲双胍组(P<0.05)。

表4 各组大鼠血糖水平和胰岛素抵抗Tab.4 Blood sugar levels and IR of rats in each

2.4 葛根素对PCOS大鼠卵巢组织病理形态变化的影响 如图1A所示，与对照组比较，模型组大鼠卵巢颗粒细胞层数较少，表面可见大小不等囊泡；二甲双胍组颗粒细胞形态完整，排列稍乱，可见少许囊泡；而二甲双胍组+葛根素组与对照组大鼠形态相似，颗粒细胞排列整齐且形态完整，无囊泡。对囊泡数目(图1B)及颗粒细胞层(图1C)统计分析显示，与对照组比较，模型组大鼠卵巢囊泡数目增加(P<0.01)颗粒细胞层厚度减少(P<0.01)；与模型组比较，二甲双胍组和二甲双胍+葛根素组大鼠囊泡数目均减少(P<0.05，P<0.01)，颗粒细胞层厚度均增加(P<0.05，P<0.01)，且二甲双胍+葛根素组作用更显著(P<0.05)。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与二甲双胍组比较，△P<0.05。图1 各组大鼠卵巢形态病理形态变化Fig.1 Morphological and pathological changes of rat ovary in each

2.5 葛根素对PCOS大鼠炎性因子水平的影响 如表5所示，与对照组比较，模型组和二甲双胍组大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP水平均升高(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组和二甲双胍+葛根素组大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP水平均降低(P<0.05)；二甲双胍+葛根素组大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP水平低于二甲双胍组(P<0.05)。

表5 各组大鼠炎性因子水平Tab.5 Inflammation factors levels of rats in each

2.6 葛根素对PCOS大鼠卵巢组织TLR4、NF-κB、ox-LDLmRNA表达的影响 如表6、图2所示，与对照组比较，模型组和二甲双胍组大鼠卵巢组织TLR4、NF-κB、ox-LDL表达均升高(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组和二甲双胍+葛根素组大鼠卵巢组织TLR4、NF-κB、ox-LDL表达均降低(P<0.05)；二甲双胍+葛根素组大鼠卵巢组织TLR4、NF-κB、ox-LDL表达低于二甲双胍组(P<0.05)。

表6 各组大鼠卵巢组织TLR4、NF-κB、ox-LDL mRNA表达Tab.6 mRNA expressions of TLR4,NF-κB and ox-LDL in ovarian tissues of rats in each

图2 各组大鼠TLR4、NF-κB及ox-LDL mRNA表达图Fig.2 mRNA expressions of TLR4,NF-κB and ox-LDL of rats in each group

3 讨论

多囊卵巢综合症(PCOS)是生殖医学领域临床治疗和研究的热点、难点。LH的过量分泌会刺激卵巢分泌雄激素，雄激素的分泌过量和FSH的分泌过少，会卵泡发育受限，最终导致PCOS[9]。肥胖也与PCOS的发病相关，PCOS患者脂肪功能异常，脂肪组织分泌的瘦素会影响机体对胰岛素的敏感性，从而导致胰岛素抵抗，血糖失调，促进PCOS发展[10]。此外，有学者发现PCOS患者卵巢组织中，存在淋巴细胞和巨噬细胞的浸润，认为PCOS可能是一种慢性炎症。患者血液中TNF-α、CRP、IL-6水平均升高，而炎症因子异常加重患者胰岛素抵抗，导致卵泡发育障碍[11]。本研究拟从体质量、性激素水平、胰岛素抵抗、炎症因子水平这几个方面探索治疗PCOS的靶点。本研究通过DHEA皮下注射建立PCOS大鼠模型，与对照组大鼠比较，PCOS大鼠体质量增加，FSH水平降低，LH、T水平升高，从血糖和胰岛素水平来看，PCOS大鼠FBG、2 h PBG、FINS、IR水平均升高，炎性因子IL-6、TNF-α、CRP水平也升高，同时大鼠卵巢颗粒细胞层数减少，表面可见大小不等囊泡，说明PCOS大鼠模型建立成功。

二甲双胍是常见的2型糖尿病口服药，也被用于PCOS的治疗。研究表明，接受二甲双胍治疗后，PCOS患者胰岛素敏感性提高，血清T、LH水平降低，FSH水平升高[12]。另有针对肥胖PCOS患者的研究发现，应用二甲双胍后患者FINS水平下降，月经周期改善，血清T水平下降[13]。姜晓琳等[14]发现二甲双胍用于PCOS大鼠，可以降低大鼠血清炎症因子水平。本研究发现二甲双胍治疗组大鼠体质量下降，FSH水平升高，LH、T水平降低，血糖和胰岛素水平均降低，同时炎性因子水平也降低，与文献结果一致。

葛根素是从葛根中提取的异黄酮类衍生物，在临床应用已超过十年。葛根素被证明可以降低血脂、胰岛素抵抗和雄激素水平[15-16]。本研究联合葛根素注射液和二甲双胍用于治疗PCOS大鼠，结果发现治疗后PCOS大鼠体质量、性激素水平、胰岛素抵抗、血糖水平均下降，且对降低LH、T水平，降低囊泡数量，提高颗粒细胞层厚度和改善FINS、IR作用更显著，说明葛根素对改善卵巢形态有明显作用。炎症反应中，TLR4激活后，通过IL-1受体的相关激酶家族成员及磷酸化激活TGF-β活化酶，进一步激活NF-κB的上游抑制蛋白，并使IκB磷酸化降解，导致NF-κB p65入核，诱导炎症因子的表达[17]。近来研究发现TLR4广泛存在于组织和细胞中，TLR4激活可促进胰岛素抵抗，因此调节TLR4可以改善胰岛素功能[6]。Guo等[6]研究发现PCOS胰岛素抵抗大鼠血清中TLR4表达升高，且TLR4/NF-κB通路被激活。PCOS是一种慢性低级别炎症，尤其是伴随着胰岛素抵抗的患者，其体内IL-6、TNF-α表达增加。葛根素可以通过抑制NF-κB，抑制CRP、IL-6、TNF-α的表达，从而发挥保护糖尿病大鼠肾脏的作用[18]。雷凯雄等[19]发现葛根素能通过下调NF-κB和TGF-β抑制肝纤维化的发展。本研究中，葛根素和二甲双胍联用组对LH、T、FINS、IR、IL-6、TNF-α水平的改善作用均优于二甲双胍单独使用组，同时联用组TLR4、NF-κB和ox-LDL表达低于单独使用二甲双胍组，说明葛根素有可能通过调控TLR4/NF-κB通路，以降低PCOS大鼠炎症因子水平，从而达到治疗PCOS、促进排卵的目的。另外ox-LDL也可以与TLR4结合，并激活NF-κB，促进炎性因子产生[20]，本研究中联用组比单独使用二甲双胍组PCOS大鼠体内ox-LDLmRNA表达更低。以上结果表明，葛根素和二甲双胍联用能加强二甲双胍的抗炎、降糖、降胰岛素作用，而这一作用可能是通过TLR4/NF-κB通路实现的。

综上所述，葛根素作为一种代谢快、毒性小、价格低的药物，可以降低PCOS大鼠血糖水平、胰岛素抵抗、性激素水平、炎性因子水平和ox-LDL表达，其可能是通过调控TLR4/NF-κB通路实现的。