刘玉洁 韩勇
(山东省日照市动物疫病预防控制中心 276800)
2021 年8 月2 日,山东畜牧兽医局印发《山东省重点动物疫病监测净化工作方案(2021 版),要求推进全省重点动物疫病监测净化,提高规模养殖场管理水平和疫病防控能力,推动动物疫病防控从稳定控制到净化消灭转变。2021 年10 月7 日,农业农村部下发《关于推进动物疫病净化的意见》,要求推进动物疫病净化工作,力争通过5 年时间,在全国建立一批高水平的净化场。
布鲁氏菌病(Brucellosis)又称马耳他热或波状热,是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人畜共患自然疫源性传染病,布鲁氏菌常引起动物流产、不孕,故又被称之为传染性流产病[1]。我国农业农村部将其列为二类动物疫病,可感染人类及多种家畜和野生动物,引起相似的临床症状与病理损伤,如发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等,严重危害人类健康和畜牧业生产[2]。在世界动物卫生组织疫病名录中,牛结核病被列为B 类动物疫病,我国将其列为二类动物疫病。牛结核病的流行对养殖业及民众健康都会造成严重的危害[3]。炭疽杆菌是由炭疽芽孢杆菌引起的一种人畜共患传染病,卫生部门将其列为法定报告的乙类传染病,农业部门将其列为多种动物共患的二类动物疫病。
以上3 种疫病均为人畜共患病,能对动物和人造成严重危害,尤其是布病近年来在日照市人感染较多,为从源头控制疫病,日照动物疫病预防控制中心选择2 家奶牛场,6 家羊场,通过2 年持续监测,了解布氏杆菌、结核分枝杆菌和炭疽杆菌病原感染状况,为净化提供技术支撑。
选择8 家规模牛羊场,其中奶牛场2 家,羊场6 家(3 家免疫布病疫苗,3 家未免疫布病)。按照置信水平95%,预期流行率6%,每次采样不少于50 份。每头奶牛采集血清、抗凝血。每只羊采集血清。每个牛羊场采集环境拭子10 份(见表1)。
表1 2020~2021 年采样情况统计(单位:个)
1.2.1 血清
每头牛羊用促凝血管采集血5ml,室温静置30min 后,3000r/min 离心3~5min,取上层血清1~1.2ml 放1.5ml 离心管中,在离心管盖上编号。
1.2.2 抗凝血
每头牛用颈静脉或尾静脉采血,加入肝素抗凝剂采集血3ml,颠倒混匀3~5 次,室温静置30min 后在采样管上编号。
1.2.3 环境拭子
采集牛羊场环境样品,采集至少3 个畜舍、粪污处理点、饲料储存点等高风险区10 份样品。
布病竞争ELISA 试剂盒、结核γ-干扰素ELISA 试剂盒购自武汉科前公司。布病虎红平板凝集抗原购自哈药集团。炭疽荧光PCR 试剂盒购自北京世纪元亨公司。牛型、禽型结核菌素购自瑞士BOVIGAM。
自动核酸提取仪960 购自西安天隆公司,实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司,全波长酶标仪购自美国MD 公司,高速冷冻离心机购自Sigma 公司等。
1.5.1 布氏杆菌
对3 家未免疫疫苗的羊场采用布病虎红平板凝集试验(RBT)和布病竞争ELISA(cELISA)进行检测。cELISA 检测阳性的确诊为阳性,RBT 检测阳性的再用cELISA 或布病试管凝集试验(SAT)进行确诊。对3 家免疫疫苗的羊场采集血清用RBT 和cELISA 进行免疫效果初筛,RBT 阳性的用cELISA或布病试管凝集试验(SAT)进行确定。RBT 和SAT 参照动物布鲁氏菌病诊断技术(GB/T18646-2018),cELISA 试验严格按照试剂盒说明书进行。
1.5.2 结核分枝杆菌
对两家规模牛场采用结核分枝杆菌γ-ELISA 试验和变态变态反应(PPD),任何一种方法检测阳性的诊断为阳性。结核分枝杆菌γ-ELISA 试验严格按照试剂盒说明书,PPD 按照动物结核病诊断技术(GB/T18645-2020)执行。
1.5.3 炭疽杆菌
对8 家规模牛羊场采集环境样品,提取病毒核酸,进行炭疽杆菌荧光PCR 检测,操作严格按照试剂盒说明书进行。
由表2 可知2020~2021 年连续2 年对8 个牛羊场进行检测,仅在2020 年1 个羊场中检测出2 份布病样品。2021 年均未检测到布氏杆菌、结核分枝杆菌和炭疽杆菌,说明日照市净化成效显著。
表2 2019-2021 年场病原学场阳性率统计(单位:个)
由表3 可知,2020~2021 年,对接受布病免疫的3 个羊场进行检测,2 个羊场布病免疫抗体水平均超过70%,达到保护要求,其中1 个羊场抗体水平低于70%,应适当调整免疫程序,提高抗体水平。
表3 布病疫苗免疫抗体水平统计(单位:份)
根据2020~2021 年连续监测结果可知,8 个牛羊场,布氏杆菌、结核分枝杆菌和炭疽杆菌净化效果较好,仅有1 个羊场在2020 年检测出2 份布病样品。到2021 年,全市有5 家牛羊场通过省级“布鲁氏菌净化场”,畜间达到稳定控制标准,人间病例呈下降趋势。
布病平板凝集试验(RBT)检测抗体是IgG 类,敏感性高,操作简单,但容易出现假阳性,在实际应用中常作为初筛手段。布病试管凝集(SAT)特异性高、敏感性高,耗时较长,常作为血清学确诊手段。布病平板凝集和ELISA 有一定的假阳性率,试管凝集有一定假阴性率[4]。竞争ELISA 方法操作精准,结果简明,可避免人为的误判[5]。在临床应用中,常需两种或两种以上方法相互配合。本次监测采用布病RBT、cELISA进行初选,SAT 进行确诊,净化效果显著。
本监测对400 份样品同时进行牛结核菌PPD 试验和γ-干扰素ELISA 试验,检测均为阴性。陈建豪对433 份样本用γ-干扰素ELISA 检测与皮内变态反应方法进行比对,两者敏感性为84%,特异性为96.81%,符合率为96.07%(416/433)[6]。朱建华等对29 头结核阳性牛同时进行牛结核菌素PPD 试验和γ-干扰素ELISA 试验,符合率82.6%[7]。由于PPD 存在游标卡尺测量误差等缺点,γ-干扰素ELISA 存在循环的γ-干扰素水平过高、使用药物等因素影响。本次监测采用PPD 和ELISA 联合监测净化,效果更好。
经过2 年持续监测,8 个牛羊场布氏杆菌、结核分枝杆菌和炭疽杆菌净化效果较好,仅有1 个羊场在2020 年检测出2 份布病样品,以上条件说明日照市牛羊场具备开展布氏杆菌、结核分枝杆菌净化条件。布氏杆菌仍在2020 年检出1 个场检出病原阳性,说明日照市布病仍存在风险。下一步要继续采取消毒、生物安全措施,做好净化工作。