血清HBV RNA预测慢性乙型肝炎患者停药后复发的meta分析

张琪 王余彦 秦波

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一个全球性问题[1]。肝内共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)是导致HBV感染慢性化的主要原因[2]。而肝内cccDNA的清除被认为是慢性乙型肝炎(CHB)完全治愈[3-4]。但无论是核苷类似物NAs还是干扰素IFN均无法直接作用于肝内cccDNA，因而完全治愈几乎无法实现。目前各种指南及专家共识多将功能性治愈暨临床治愈[4-7]作为CHB治疗的理想终点，而未对肝内cccDNA水平进行监测。肝内cccDNA的存在，使得这些经过长期抗病毒治疗、甚至是实现了功能性治愈的患者，停药后仍面临着复发的风险。

肝内cccDNA水平的测定需进行有创性肝穿刺，临床上难以普及。因而，亟待找寻一种可反映肝内cccDNA水平的无创性新型血清学标志物。血清HBV RNA就是近年研究的热点之一[8]。已有学者证实血清HBV RNA实际上是由前基因组RNA(pregenomic RNA, pgRNA)及其剪切变异体形成的病毒样颗粒或衣壳抗体复合物[9-11]。PgRNA由肝内cccDNA直接转录形成，因而血清HBV RNA在反映肝内cccDNA存在及活性方面都具有优势[12-14]。

最近，一些研究[15-20]开始关注停药时血清HBV RNA状态与停药后复发之间的关系。本meta分析将探讨停药时血清HBV RNA状态与停药后复发情况之间的内在联系，为今后寻找指导安全停药的新型血清学标志物提供依据。

资料与方法

一、 文献检索

检索PubMed、Embase、Web of science、Cochrane library以及网站https://clinicaltrials.gov/，搜集2016至2020年期间发表的关于血清HBV RNA与CHB患者停药后复发之间关系的相关英文文献。检索词为血清HBV RNA和CHB的英文(具体如下: “HBV RNA” or “HBV pgRNA” or “HBV pregenomic RNA” or “hepatitis B virus RNA” or “hepatitis B virus pgRNA” or “hepatitis B virus pregenomic RNA”和“hepatitis B, chronic” or “chronic hepatitis B” or “chronic hepatitis B virus Infection” or “hepatitis B virus infection,chronic”)。同时进行手工检索。以PubMed为例，具体检索策略见图1。本研究在注册前进行了预检索，相关中文研究数量少，以综述为主，基本无符合纳入标准的文献；因而着重检索了英文文献。(PROSPERO网站注册号: CRD42020208267)。

二、 纳入与排除标准

(一) 纳入标准 (1)研究对象为长期接受抗病毒治疗并停药的CHB患者；(2)文章提供所需数据；(3)队列研究；(4)英文文献。

(二) 排除标准 (1)研究对象不符合前述条件；(2)文章无法提供所需数据；(3)非队列研究；(4)其他语种文献，重复文献，不能进行meta分析的文献。

三、 文献筛选与数据提取

严格按照纳入及排除标准进行文献筛选。对于最终纳入本meta分析的文献，研究者将提取以下信息：(1)作者、发表年份、国家及研究类型；(2) 目标人群基本特征(包括人数、患者基本情况)；(3)停药时血清HBV RNA状态、随访时间、停药后复发情况；(4)血清HBV RNA检测为阴性的标准、具体的停药标准及复发的定义。两位研究者分别独立进行数据提取，出现任何分歧都将进行讨论后达成共识或者通过咨询第三位研究者来解决。

四、 结局指标 分析所有纳入文献的特点，由于文献的描述广泛，故大致考虑复发标准如下：(1)临床复发：停药后出现血清丙氨酸转氨酶(ALT)异常升高；(2) 病毒学复发：停药后血清HBV DNA水平异常升高。并从最终纳入的文献中提炼出复发的具体定义。

五、 纳入文献的质量评价 由于纳入的研究均为队列研究，因而使用纽卡斯尔渥太华量表(NOS)23来评估每项研究的质量。大于6分为高质量文献。

六、 统计分析 所有统计学分析均采用Revman 5.3软件进行。通过计算风险比(RR)和95%CI来确定停药时血清HBV RNA状态与停药后复发之间的关系。总效应采用Z检验，如果P<0.05，则认为组间差异有统计学意义。紧接着将进行异质性检验，如果存在显著的异质性(I2>50%)，使用随机效应模型；如果异质性较小(I2<50%)则采用固定效应模型。为了探寻导致异质性的潜在原因，将对存在显著异质的研究进行亚组分析。最后进行敏感性分析评估此次meta分析的结果是否稳健可靠。若有10项以上的研究纳入本meta分析，将使用漏斗图来评估发表偏倚。

结 果

一、 文献检索结果

初步检索共得到599篇文献，其中Web of science检索到159篇文献，Pubmed检索到104篇文献，Embase检索到240篇文献， Cochrane library检索到91篇文献，Clinical trials共检索到13个相关研究，但均未提供相关数据结果或处于研究未完成状态，因而未纳入；同时手工检索到5篇文献。首先排除267篇重复文献，然后通过阅读标题和摘要排除314篇文献，最后通过阅读全文排除14篇文献。最后，来自4篇文章[17-20]的6项独立研究被纳入本次meta分析，为了区分来自同一篇文章的不同研究，采用”作者名字1”和”作者名字2”来区分。所有纳入研究均为队列研究，在2016年至2020年间以英文发表。具体文献筛选流程如图1所示。

图1 文献筛选流程图

二、纳入文献基本特征及质量评价

表1总结了最终纳入研究的特点及NOS评分。

表1 文献基本特征及质量评价表

三、meta分析结果

(一) 临床复发情况 来自3篇文章中的4项研究[16-18]报道了停药后的临床复发情况。根据患者停药时HBV RNA状态，将患者分为HBV RNA阳性组和HBV RNA阴性组。其中HBV RNA阳性组共133例患者，有49例患者在停药后出现了临床复发；而HBV RNA阴性组71例患者中仅有8例在停药后出现临床复发。研究之间的异质性较小(Chi2=3.41,P=0.33,I2=12%)，因而采用固定效应模型进行分析。meta分析结果显示，停药时血清HBV RNA阳性患者在停药后出现临床复发的风险更高(RR=2.98, 95%CI=1.55～5.72,P=0.001，图2)。

图2 临床复发情况

(二) 病毒学复发情况 来自4篇文章的6项研究[15-18]报告了停药后的病毒学复发情况。此项分析共纳入256例患者，其中HBV RNA阳性患者156例，HBV RNA阴性患者100例。研究之间存在显著的异质性(Chi2=34.11,P<0.01,I2=85%)，故采用随机效应模型进行分析。结果显示，相比于血清HBV RNA阳性患者，血清HBV RNA阴性患者停药后病毒学复发率较低(39%, 39/100 vs 67.3%, 105/156,P=0.07，见图3)，但差异并无统计学意义。

图3 病毒学复发情况

(三) 异质性检验 为探讨报道病毒学复发的研究之间异质性的可能原因，对以下四个方面进行亚组分析，包括样本人数、随访时间、血清HBV RNA检测为阴性的标准、病毒学复发的定义。亚组分析的结果显示，小样本数量(样本人数<30Chi2=9.44,P=0.009,I2=79% vs样本人数>30Chi2=2.27,P=0.32,I2=12%))和病毒学复发定义的不同(HBV DNA>20 iu/mLChi2=25.03,P<0.01,I2=92% vs HBV DNA>2000 IU/mLChi2=1.05,P=0.31，I2=5%)可能是造成研究间显著异质性的原因。而随访时间的不同(随访时间<3年Chi2=25.03，P<0.01，I2=92% vs随访时间>3年Chi2=11.79，P=0.003，I2=83%)、血清HBV RNA检测为阴性的标准不一致(HBVR RNA低于LLOQChi2=10.52，P=0.001，I2=90% vs HBV RNA 检测不到Chi2=17.89，P=0.0005，I2=83%)不能解释异质性。

(四) 敏感性分析 采用逐一排除文献法。在本meta分析中，排除任何一项研究都不会过度影响异质性，因而考虑本次meta分析结果相对稳健。但对于报道临床复发的4项研究[18-20](所有纳入研究之间异质性较小I2=12%)，必须提到的是，在排除Ivana1 2020这项研究之后，异质性(P=0.94,I2=0%)消失了。进一步研究后发现，该研究对于临床复发标准的定义较其他研究更具包容性，即ALT>10 ULN(检测上限)时才认为临床复发，远远高于多种指南中常用的ALT水平。但总的来说，敏感性分析显示了本次meta分析结果的稳定性。

(五) 发表偏倚 由于在本meta分析中只有不到10项研究，使用漏斗图来评估发表偏倚是非常受限的，因而未采用漏斗图评估发表偏倚。但本次meta分析的发表偏倚是可以合理推断的，因为大多数纳入的研究都是在2020年发表的，且未对灰色文献进行专门的检索。

讨 论

肝内cccDNA的持续存在使CHB患者停药后仍面临复发风险。临床工作中，肝内cccDNA的监测因有创性肝活检而受限。血清HBV RNA与肝内cccDNA有良好的相关性，在一定程度上可以反映肝内cccDNA的存在。因而本meta分析探讨了停药时血清HBV RNA状态与停药后复发之间的关系。

本meta分析结果显示，停药时血清HBV RNA阳性的患者停药后出现临床复发的风险更高(RR=2.98, 95%CI=1.55～5.72,P=0.001)。研究间异质性较小，采用固定效应模型。敏感性分析表明，虽然存在一定的异质性，但结果是稳健可靠的。同时，本meta分析发现，相比于HBV RNA阳性患者，停药时血清HBV RNA阴性患者病毒学复发率较低(39% vs 67.3%,P=0.07)，但差异无统计学意义。有研究表明，停药后病毒学复发情况的研究间存在显著的异质性，因而研究者进行了亚组分析，结果表明产生异质性的主要原因是样本数量和病毒学复发定义的不同。

抗病毒药物如NAs或IFNs不能清除肝内cccDNA。所以即使达到了理想的治疗终点——功能性治愈之后再停止治疗，患者也有可能出现复发。这一点在本meta分析中得到了部分证实，那些在停药时血清HBV RNA为阳性的患者，或者换句话说，其cccDNA仍处于激活状态的患者在停药后更有可能出现临床复发。另一方面，停药时血清HBV RNA阴性的患者病毒学复发率确实更低，但在本meta分析中差异无统计学意义。这一结论看起来似乎与临床实践不符。因此研究者进一步行亚组分析以探讨原因。结果表明，样本量和病毒学定义的不同可能是造成这些研究之间显著异质性的原因。

综上，血清HBV RNA对于预测CHB患者停药后复发有重要意义。本meta分析首次系统探讨了血清HBV RNA在预测CHB患者停药后复发方面的意义，为进一步寻找安全停药的新指标提供了依据。但本meta分析仍然有一些局限性。首先，纳入本次meta分析中的研究是非常有限的，灰色文献没有被专门搜索，这可能会导致发表偏倚，影响结果的稳定性。第二，结局指标的定义和停药的标准虽然相似，但并不完全一致，尽管研究者已经进行了亚组分析以减少由此引起的异质性。第三，目前相关研究总体较少，此次meta分析研究总量少于10例，可能造成研究的局限性。

综上所述，血清HBV RNA是协助预测停药后临床复发的重要生物标志物。未来还需进一步深入研究。