孕酮及其受体、IL-8与原因不明自然流产的相关性研究①

马铭艳 杨美霞 宫晓玲 赵紫薇 岳淑芬 宋 芳

（包头医学院组织学与胚胎学教研室，包头 014040）

自然流产病因较多且复杂，其中70%～80%原因不明。越来越多学者认为自然流产发生与母胎界面免疫微环境Th1/Th2 细胞因子失衡有关。王丽红等［1］研究发现，IL-8 是Th1 型细胞因子，其高表达可能与自然流产有关，但与别川定［2］观点不同。王巧香［3］研究发现，孕酮（progesterone，P）可促进Th2 型细胞因子分泌，维持正常妊娠。据统计，由于P 不足发生先兆流产患者肌内注射黄体酮治疗后，仍有部分患者保胎失败，推测可能与Th1/Th2 细胞因子失衡有关［4］。本课题组前期动物实验证明，P可抑制自然流产小鼠母胎界面蜕膜细胞分泌IL-8，维持正常妊娠［5］。但人体存在复杂的细胞因子网络，P不足是否与IL-8 表达相关尚未见报道。孕酮受体（progesterone receptor，PR）受雌孕激素双重调控，与P 特异性结合发挥作用。因此，本文通过研究P、PR和IL-8 在自然流产患者外周血及母胎界面的表达情况，揭示其中关联，为进一步探讨类固醇激素-蜕膜细胞-细胞因子在自然流产中的调节机制奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研 究 对 象 取2019 年5 月 至2020 年5 月包钢第三职工医院妇产科门诊就诊，出现少量阴道出血，B 超提示胚胎死亡，需进行清宫的30 例原因不明自然流产患者作为流产组。纳入标准：①首次发生自然流产；②夫妻双方染色体核型正常，男方精液常规检查正常；③患者无生殖道解剖学异常；④无主动免疫治疗史。排除标准：遗传性疾病、内分泌系统疾病、急慢性疾病、血液病、器质性病变、不良饮食史、服药史及年龄≥40 岁患者。随机选取同期正常早孕妇女30 例作为对照组，无自然流产史，无腹痛、阴道流血等症状，自愿行人工流产术，B 超提示胚胎发育正常。两组一般资料差异无统计学意义，具有可比性。本研究经包头医学院伦理委员会审批，所有研究对象知情同意。

1.1.2 主要试剂 P、IL-8 ELISA 试剂盒（上海联硕生物科技有限公司）；兔抗人PR 抗体（英国Abcam公司）；兔抗人IL-8 抗体（美国Santa Cruz 公司）；PV-6000 试剂盒及DAB 显色液（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 标本收集与处理 所有研究对象均于清晨空腹抽取肘正中静脉血3 ml，1 h 内2 000 r/min 离心10 min，取上清，每人份分装2 管，-20 ℃保存。流产组和对照组在施行清宫术时收集绒毛及蜕膜组织，生理盐水冲洗干净后Bouin's 液固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋制成蜡块保存。

1.2.2 ELISA 按照ELISA 测定试剂盒说明书，依次在预包被板中加入标准品或待测样品（37 ℃、120 min）、生物素化抗体（37 ℃、60 min）、辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白（37 ℃、120 min）、TMB 显色液37 ℃暗处反应5～10 min，加入终止液混匀，酶标仪检测450 nm处吸光度。

1.2.3 HE 染色 各蜡块标本均切为5 μm，常规脱蜡水化，苏木素染色3 min，加入1%盐酸乙醇反应5 s，加入氨水反应5 s；伊红染色2 min，乙醇脱水，透明，封片，镜检。

1.2.4 免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡水化，EDTA 抗原修复液微波修复10 min，加入0.3%H2O2-甲醇室温孵育10 min，滴加兔抗人PR 抗体（1∶400）、兔抗人IL-8 抗体（1∶200）4 ℃孵育过夜；滴加辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG 抗体室温孵育20 min，DAB 显色6～10 min。苏木素复染细胞核，常规脱水，透明，封片，镜检。PBS 代替一抗作为阴性对照，200 倍光镜下每张切片选取5 个视野，Image Pro Plus 6.0 图像分析软件计算平均光密度值表示PR、IL-8 蛋白相对表达，免疫组织化学染色切片进行半定量分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以xˉ±s 表示，采用独立样本t检验；P、PR与IL-8相关性分析采用Pearson等级相关性分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA 测定 ELISA 结果显示，流产组血清P水平明显低于对照组（P<0.01）；流产组血清IL-8 水平明显高于对照组（P<0.01，表1）。

表1 两组血清P、IL-8水平比较（±s）Tab.1 Comparison of serum P and IL-8 concentrations in two groups（±s）

表1 两组血清P、IL-8水平比较（±s）Tab.1 Comparison of serum P and IL-8 concentrations in two groups（±s）

Note：1）P<0.01 vs control group.

IL-8/（pg·ml-1）1 411.03±256.241）628.45±175.36 Groups Abortion Control P/（nmol·L-1）27.38±3.171）64.21±6.35

2.2 HE 染色 绒毛组织中，流产组绒毛上皮变薄，细胞嗜酸性增强，结缔组织细胞纤维素样变。对照组绒毛上皮合体滋养层细胞较多，细胞膜界限不清，流产组细胞滋养层细胞界限清晰，绒毛内结缔组织细胞呈星芒状排列（图1A）。蜕膜组织中，流产组蜕膜细胞失去细胞间连接，细胞质嗜酸性增强，对照组蜕膜细胞体积较大，呈砌砖样紧密排列，细胞界限清晰，细胞核呈圆形或卵圆形，位于细胞中央，着色浅（图1B）。

图1 流产组与对照组绒毛组织、蜕膜组织HE染色（×200）Fig.1 HE staining of villi and decidua in abortion group and control group（×200）

2.3 免疫组织化学染色

2.3.1 绒毛和蜕膜中PR 和IL-8 蛋白组织学定位免疫组织化学染色结果显示，两组绒毛组织PR蛋白表达均为阴性，两组蜕膜组织中PR 均表达于蜕膜细胞的细胞核，呈棕黄色颗粒（图2A）。两组绒毛组织中IL-8 均表达于绒毛上皮细胞的细胞质，呈棕黄色颗粒，两组蜕膜组织中IL-8 均表达于蜕膜细胞的细胞质，呈棕黄色颗粒，各组阳性反应均强弱不等（图2B）。

图2 两组绒毛和蜕膜组织中PR、IL-8表达（×200）Fig.2 Expressions of PR and IL-8 in villi and decidual tissues in two groups（×200）

2.3.2 PR 和IL-8 免疫组织化学染色半定量分析流产组蜕膜组织中PR 含量明显低于对照组（P<0.01）。流产组绒毛组织中IL-8 含量明显高于对照组（P<0.01）。流产组蜕膜组织中IL-8 含量高于对照组（P<0.05，表2）。

表2 两组绒毛和蜕膜组织中PR、IL-8蛋白含量比较（±s）Tab.2 Comparison of PR and IL-8 protein contents in villi and decidua in two groups（±s）

表2 两组绒毛和蜕膜组织中PR、IL-8蛋白含量比较（±s）Tab.2 Comparison of PR and IL-8 protein contents in villi and decidua in two groups（±s）

Note：0. Negative expression；1）P<0.05，2）P<0.01 vs control group.

IL-8 Villi Decidua 0.140±0.0092） 0.164±0.0891）0.131±0.018 0.109±0.063 Groups Abortion Control PR Villi Decidua 0 0.109±0.0172）0 0.148±0.020

2.4 P、PR 与IL-8 相关性分析 流产组血清P 与IL-8呈显著负相关（r=-0.870，P<0.01），流产组蜕膜组织PR 与IL-8 水平呈显著负相关（r=-0.650，P<0.01，图3）。

图3 相关性分析Fig.3 Correlation analysis

3 讨论

自然流产指妊娠<28周、胎儿体重<1 kg、非人为原因导致的流产，其病因受到广泛关注，母体类固醇激素水平异常、母胎界面Th1/Th2 细胞因子失衡都可能导致自然流产。生殖免疫学认为，正常妊娠以Th2 型细胞为主，当向Th1 型细胞偏离时，Th1 型细胞分泌IL-8、IFN-γ、TNF-α 等促炎因子，抑制Th2型细胞增殖，破坏母胎界面免疫微环境，引发流产［6-9］。因此，维持正常免疫平衡是降低流产发生率的关键。

P 是一种天然孕激素，妊娠早期，黄体分泌大量P，使血清P 含量不断升高，与Ca2+结合降低子宫平滑肌兴奋性，促进胚泡着床，一定程度防止流产发生；但黄体功能异常、P 分泌减少则易发生先兆流产等［10-11］。因此，P 水平对早期妊娠维持十分重要。RAGHUPATHY 等［12］研究发现，P可通过抑制淋巴细胞产生Th1 型细胞因子，上调Th2 型细胞因子表达，维持Th1/Th2 细胞因子平衡。此外，TAN 等［13］研究发现，P与A型PR结合可增强Th1型细胞因子表达，具有杀胚作用，与B 型PR 结合可降低Th1 型细胞因子表达，对滋养层细胞和胎儿起保护作用。

IL-8 是Th1 型细胞分泌的一种炎症因子，对中性粒细胞、T 淋巴细胞、嗜碱性粒细胞具有趋化作用，并可激活中性粒细胞，引发炎症反应，还可与TNF-α 等促炎因子共同破坏母胎界面免疫微环境，促使滋养层细胞凋亡，影响胎盘功能。

本研究发现，自然流产患者血清P 水平明显低于正常妊娠者，与谢雪梅等［14］结论一致。研究证实，妊娠早期，P 分泌不足，导致子宫平滑肌兴奋性增强，易发生自然流产等。免疫组织化学染色结果表明，流产组蜕膜组织中PR 含量明显低于对照组，与李新菊［15］研究结论一致。正常妊娠时，P 与PR 特异性结合，促进子宫内膜基质细胞转化为蜕膜细胞，为胚胎发育提供营养物质，维持妊娠；PR表达减少，影响P 生理功能，增强子宫平滑肌兴奋性，使蜕膜组织发生不同程度凋亡、坏死，引发流产。

本研究发现，自然流产患者血清、绒毛和蜕膜组织中IL-8 水平明显高于正常妊娠者，与许云霞［16］研究结论一致。原因可能为绒毛和蜕膜组织中的免疫细胞被激活，释放IL-8、TNF-α 等促炎因子，引发炎症反应，同时损伤胎儿胎盘组织，引发自然流产。

此外，本研究发现，P 与IL-8 以及PR 与IL-8均呈负相关，提示P、PR 可能对IL-8 具有一定抑制作用，从而减少母胎界面炎症因子释放、淋巴细胞活化，使胚胎免受母体免疫系统杀伤，减少中性粒细胞侵入蜕膜组织，从而维持正常妊娠。HORIE等［17］通过研究子宫内膜异位症患者基质细胞，发现P 可通过抑制NF-κB 信号通路下调IL-8 表达。P 通过哪种信号途径调节自然流产患者IL-8 表达尚无文献报道。

综上所述，P、PR 低表达、IL-8 高表达均可能引发自然流产，且P、PR 可能对IL-8 有一定抑制作用。因此，进一步从类固醇激素-蜕膜细胞-细胞因子网络揭示P下调IL-8表达的分子机制可为早期自然流产防治提供理论依据。