细粒棘球蚴通过STAT6促进巨噬细胞向M2型极化①

冯叶叶 许军英 逯君霞 侯 隽 王良海 吴向未 陈雪玲 （石河子大学医学院，石河子 832002）

棘球蚴病是一种由棘球绦虫属绦虫的幼虫引起的人畜共患疾病，细粒棘球蚴（Echinococcus granu⁃losus）幼虫引起的囊性棘球蚴病较为常见。中国西部是全球流行病最严重的地区之一，包括内蒙古、四川、云南、西藏、陕西、甘肃、青海、宁夏、新疆和新疆生产建设兵团等9 个省级行政区划的370 个县［1-2］。细粒棘球蚴的生命周期中主要包括中间宿主和终宿主，人类可以作为中间宿主，其临床症状与靶器官的损伤或功能障碍有关。细粒棘球蚴的幼虫阶段主要居住在中间宿主的肝脏（70%）和肺部（20%），其余部分包括脑、脾、肾和心脏［3］。细粒棘球蚴幼虫侵入实质脏器后，发生免疫逃逸，形成囊肿［4］。囊肿破裂后会引起全身或局部过敏反应，甚至死亡，治疗复杂，对患者的生活质量产生了严重的影响［5］。尽管人们已经对其进行了广泛地研究，然而，其相关分子机制仍不完全清楚。

巨噬细胞在不同条件下，根据其释放的细胞因子、细胞表面标志物等不同，分为两种活化状态：M1型经典活化型和M2型替代活化型。M1型巨噬细胞相关因子主要有CD86、TNF-α、IL-1β、IL-6 等，发挥清除细菌病毒、促进炎症等效应。M2型巨噬细胞相关因子主要包括CD206、IL-10、精氨酸酶1（argi⁃nase，ARG1）、IL-4、TGF-β等，从而发挥抑制炎症、参与组织修复等效应［6］。

信号转导和转录激活因子STAT 家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和STAT6［7］。信号转导和转录激活因子6（signal trans⁃ducer and activator of transcription 6，STAT6）在机体的各种生理病理过程中发挥重要作用，包括参与机体的免疫应答，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移等［8］。STAT6 的激活是巨噬细胞发挥功能的关键信号通路，是M2 型巨噬细胞激活所必需的，IL-4 和IL-13 是M2 型巨噬细胞的关键因子，通过STAT6 发挥作用，诱导其磷酸化并促进STAT6 参与基因的转录［9］。棘球蚴病作为一种感染性疾病，对于STAT6的表达研究尚未见报道。因此，本研究探讨细粒棘球蚴感染是否可影响巨噬细胞向M2 型极化，进一步采用STAT6 抑制剂探讨STAT6 在细粒棘球蚴诱导巨噬细胞M2 型极化中的作用，为进一步研究治疗囊性棘球蚴病的潜在分子靶标提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细粒棘球蚴囊液来源 细粒棘球蚴囊液（Echinococcus granulosuscyst fluid，EgCF）采集于新疆维吾尔自治区石河子市屠宰场病羊肝脏。

1.1.2 细胞来源 巨噬细胞系Raw264.7 购自上海生命科学研究院细胞库。

1.1.3 主要仪器与试剂 DMEM 高糖培养基（货号：C11995500BT）、特级胎牛血清FBS（货号：04-001-A）、青链霉素（货号：SV30010）、ACK 红细胞裂解液（货号：A1049201）、磷酸盐缓冲液PBS（货号：c20012500bt）购自美国Life-Gibco 公司；二甲基亚砜DMSO（货号：＃D8370）购自北京索莱宝生物公司；总RNA 提取试剂盒（货号：R6834-01）购自美国Omega 生物技术公司；Nanodrop2000 购自Thermo Fisher Scientific，USA；逆 转 录 试 剂 盒（货 号：K1622）购自赛默飞世尔科技有限公司；荧光染料SYBR Green Ⅱ（货号：RR820A）购自TaKaRa；PE anti-mouse CD206（货号：85-12-2061-80）、PE antimouse TNF-α（货号：12-7321-81）、Intracellular Fixa⁃tion/Permeabilization Buffer（货 号：88-8824-00）、Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set（货号：00-5523-00）、Cell Stimulation Cocktail（plus protein transport inh）（货号：00-4975-93）购自eBioscience 公司；重组Anti-STAT6 抗体（货号：ab32520）购自Abcam 公司；STAT6 抑制剂AS1517499（货号：HY-100614）购自美国MCE 生物科技公司；FITC 标记山羊抗兔（货号：ZF-0311）购自北京中杉金桥公司；Mouse IL-6 ELISA Kit（货号：70-EK2062/2）购自联科集团有限公司。

逆转录仪器（TaKaRa，11007136）；荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad 公司，785BR11656）；流式细胞仪（安捷伦科技有限公司，45-2-2005-3352-1）；酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司，3001-2140）。

1.1.4 引物 根据Genebank 中小鼠β-actin、STAT6、CD206、IL-4、ARG1、TGF-β、TNF-α、IL-1β、IL-6 的基因序列，应用Blast 进行分析和比较，选取合适的区域合成引物，所有引物由上海生工生物工程公司合成（表1）。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.2 方法

1.2.1 EgCF 的采集及制备 采用清水冲洗、乙醇消毒感染细粒棘球蚴病的新鲜羊肝脏，50 ml洁净注射器抽取包囊中清澈无污染的单囊型包囊囊液，注入无菌容器，移入无菌操作台，用0.22 μm滤菌器过滤囊液，分装备用。

1.2.2 巨噬细胞系Raw264.7的培养 配制DMEM完全培养基（50 ml 离心管中加入1 ml 青链霉素、5 ml 特级胎牛血清FBS、44 ml DMEM 高糖培养基）。细胞以1×106个/孔铺于6 孔板，并加入适量DMEM完全培养基培养。

1.2.3 STAT6 抑制剂使用浓度的配制 取20 μl STAT6 抑制剂原液（10 mmol/L），加入180 μl DMEM高糖培养基中充分溶解混匀，吸出20 μl再加入180 μl DMEM高糖培养基中充分溶解混匀，吸出20 μl再加入180 μl DMEM 高糖培养基中充分溶解混匀，即倍比稀释1 000 倍，再分别取4.2 μl、20 μl 稀释液加入DMEM 完全培养基与EgCF 混合液中，共2 ml，其最终浓度为21 nmol/L、100 nmol/L［10］。

1.2.4 EgCF 处理巨噬细胞 各孔加入1.75 ml DMEM 完全培养基。0 h 组：加入0.25 ml DMEM 完全培养基；24 h 组：加入0.25 ml EgCF。在37 ℃、5%CO2培养箱内培养，在24 h收集细胞（各设3个复孔）及细胞培养上清液备用［检测细胞因子前6 h加入Cell Stimulation Cocktail（plus protein transport inh）］。

1.2.5 EgCF 与STAT6 抑制剂处理巨噬细胞0 nmol/L组：加入1.75 ml DMEM完全培养基、0.25 ml EgCF；21 nmol/L 和100 nmol/L 组：加 入0.25 ml EgCF，STAT6抑制剂AS1517499分别以21 nmol/L 和100 nmol/L 浓度加入，补充加入DMEM 完全培养基至2 ml；溶剂组：加入DMSO。在37 ℃、5%CO2培养箱内培养24 h，收集细胞备用。

1.2.6 定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测STAT6、CD206、IL-4、ARG1、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-1β 的表达 使用总RNA 提取试剂盒提取巨噬细胞中的RNA，Nanodrop2000 检测各组样品浓度。逆转录试剂盒在逆转录仪器中进行反转录（70 ℃5 min，4 ℃2 min）、扩增（42 ℃60 min，70 ℃5 min，4 ℃∞）得到cDNA。使用荧光定量PCR 仪检测，反应体系总体积20 μl：cDNA 1.6 μl，正向引物0.8 μl，反向引物0.8 μl，荧光染料SYBR Green Ⅱ10 μl，ddH2O 6.8 μl；反应条件：95 ℃30 s 预变性；95 ℃5 s 变性，60 ℃30 s退火/延伸，共39个循环。引物序列见表1。结果用Bio-Rad CFX96 Manager进行分析。

1.2.7 流式细胞术检测STAT6、CD206、TNF-α 的表达 弃培养上清液，PBS 洗1遍，加入适量PBS，采用细胞刮轻柔刮掉细胞，将细胞转移至1.5 ml 离心管，2 000 r/min离心5 min，弃PBS，进行如下处理。

细胞胞浆内CD206、TNF-α 染色组处理：使用Intracellular Fixation/Permeabilization Buffer，每管加入100 μl PBS、200 μl IC Fixation Buffer 固定液固定细胞，室温孵育30 min，2 000 r/min 离心5 min，弃上清；每 管 加 入1 ml 1×Permeabilization，室 温 孵 育15 min，2 000 r/min 离心5 min，弃上清；逐管加入1×Permeabilization 配好的抗体PE anti-mouse CD206（1∶200）、PE anti-mouse TNF-α（1∶20），悬浮振荡细胞，室温避光孵育30 min；每管加入1 ml 1×Permea⁃bilization，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入300 μl PBS悬浮振荡细胞，在1 h内使用流式细胞仪检测。

细胞核内STAT6 染色组处理：使用Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set，每 管 加 入100 μl PBS、200 μl Fixation/Permeabilization 固定液固定细胞，室温避光孵育30 min，2 000 r/min 离心5 min，弃上清；每管加入1ml 1×Permeabilization，室温孵育15 min，2 000 r/min 离心5 min，弃上清；逐管加入1×Permeabilization 配制好的抗体Anti-STAT6（1∶30），悬浮振荡细胞，室温避光孵育1 h；每管加入1 ml 1×Permeabilization，2 000 r/min 离心5 min，弃上清；逐管加入1×Permeabilization 配好的抗体FITClabeled goat anti-rabbit（1∶100），悬浮振荡细胞，室温避光孵育1 h；每管加入1 ml 1×Permeabilization，2 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入300 μl PBS 悬浮振荡细胞，在1 h内使用流式细胞仪检测。

1.2.8 ELISA 检测上清液中IL-6 的量 收集细胞培养上清液，4 ℃、300 g 离心10 min 去除沉淀物，离心后的上清液直接用来检测。参照Mouse IL-6 ELISA Kit 说明书，倍比稀释标准品，第一排每孔按照稀释后的浓度梯度依次加入100 μl；每个样本孔加入100 μl细胞培养上清液，再向所有孔中加入50 μl稀释的检测抗体（1∶100），300 r/min 振荡并于室温孵育1.5 h。弃液体洗板6 次并甩干。每孔加100 μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（1∶100），300 r/min 振荡并于室温孵育30 min。弃液体洗板6 次并甩干。每孔加入100 μl 显色底物TMB，室温避光孵育15 min左右（肉眼观察第5孔有淡蓝色，空白孔无蓝色）。加入终止液终止反应，30 min内使用酶标仪测定吸光度（A450和A570），绘制标准曲线并计算各样品浓度。

1.3 统计学方法 使用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计学分析，3 组及以上组间的差异采用One-Way ANOVA 检验，两组间的差异采用t检验，P<0.05 代表差异具有统计学意义，ns 代表差异无统计学意义。

2 结果

2.1 EgCF 抑制M1 型巨噬细胞相关因子的表达为了研究细粒棘球蚴对巨噬细胞的影响，采用EgCF和巨噬细胞系Raw264.7 进行体外研究，EgCF 的最终浓度为0.5 mg/ml。EgCF 处理巨噬细胞24 h，通过qRT-PCR 检测M1 型巨噬细胞分泌的促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的mRNA 表达水平（图1A～C），ELISA 检测IL-6 蛋白表达水平（图1D），流式细胞术检测TNF-α蛋白表达水平（图1E）。结果显示：与0 h相比，EgCF 处理巨噬细 胞24 h 后，M1 型标志物IL-6、IL-1β、TNF-α 的mRNA 和蛋白表达均下降（P<0.01）。

图1 EgCF对M1型巨噬细胞相关分子表达的影响Fig.1 Effect of EgCF on expressions of M1 polarization related molecules

2.2 EgCF 促进M2 型巨噬细胞相关因子的表达qRT-PCR 检测M2 型巨噬细胞表面标志物CD206 以及分泌的抑炎因子IL-4、ARG1、TGF-β 的mRNA 表达水平（图2A～D），流式细胞术检测CD206 蛋白表达水平（图2E）。结果显示：与0 h 相比，EgCF 处理巨噬细胞24 h 后，M2 型巨噬细胞相关因子CD206、IL-4、ARG1、TGF-β 的表达均上升（P<0.05）。提示EgCF可促进巨噬细胞表型向M2型极化。

图2 EgCF对M2型巨噬细胞相关分子表达的影响Fig.2 Effect of EgCF on expressions of M2 polarization related molecules

2.3 EgCF 促进Raw264.7 细胞中STAT6 的表达qRT-PCR 检测巨噬细胞中STAT6 的mRNA 表达水平发现，STAT6表达呈升高趋势（图3A，P<0.01）；流式细胞术检测巨噬细胞中STAT6 的蛋白表达水平，发现其与mRNA 表达水平一致（图3B，P<0.001）。提示EgCF可促进巨噬细胞中STAT6表达。但EgCF是否通过促进STAT6 的表达促使巨噬细胞向M2 型极化需进一步研究。

图3 EgCF对Raw264.7细胞中STAT6表达的影响Fig.3 Effect of EgCF on STAT6 expression in Raw264.7 cells

2.4 STAT6 抑制剂AS1517499 可有效抑制STAT6的表达 进一步探讨EgCF 是否通过STAT6 影响巨噬细胞的极化类型。流式细胞术结果显示，STAT6抑制剂与EgCF处理巨噬细胞24 h后，加入21 nmol/L STAT6抑制剂组与DMSO 组相比STAT6的表达差异无统计学意义（图4A，P>0.05），而加入100 nmol/L STAT6抑制剂组与DMSO 组相比STAT6表达差异有统计学意义（图4B，P<0.01）。qRT-PCR 结果显示，100 nmol/L STAT6 抑制剂抑制了STAT6 的表达，差异有统计学意义（图4C，P<0.05）。提示100 nmol/L STAT6抑制剂可有效抑制STAT6表达。

图4 STAT6 抑制剂对Raw264.7 细胞中STAT6 表达的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of STAT6 inhibitor on expression of STAT6 in Raw264.7 cells

2.5 STAT6抑制剂抑制M2型巨噬细胞相关因子的表达 进一步使用100 nmol/L STAT6 抑制剂与EgCF 处理巨噬细胞24 h，qRT-PCR 检测M1 型和M2型巨噬细胞相关因子的表达水平。结果显示：M2型巨噬细胞相关因子CD206、TGF-β、IL-4 的表达被抑制（图5A～C，P>0.05），而M1 型巨噬细胞相关因子IL-6的表达被促进（图5D，P>0.05）。提示100 nmol/L STAT6 抑制剂可逆转EgCF 诱导的巨噬细胞极化类型转变，促进巨噬细胞向M1 型极化、抑制其向M2型极化。

图5 STAT6抑制剂对EgCF诱导的巨噬细胞极化的作用Fig.5 Effect of STAT6 inhibitor on EgCF induced macro⁃phage polarization

3 讨论

棘球蚴病的常见受累器官为肝脏。在炎症的发生发展过程中，固有免疫是防御的第一道防线，是肝脏受到损伤刺激后首先发生的，巨噬细胞在固有免疫反应中发挥重要的作用［11］。巨噬细胞极化是调节炎症反应的重要机制［12］。有文献报道，肝脏浸润的M2 型巨噬细胞具有免疫抑制作用［13］。已有研究发现，细粒棘球蚴能够促进巨噬细胞向M2 型极化［14］。课题组猜测其可能与细粒棘球蚴发生免疫逃逸有关。

有研究发现核转录因子对巨噬细胞的极化起重要作用。CD11b+细胞中的STAT6 信号通过促进IL-4 分泌，并增加M2 型巨噬细胞促进肺癌进展［15］。敲除STAT6 能够阻止M2 型巨噬细胞的极化和叶酸肾病中单核细胞向成纤维细胞的转变，从而减缓肾纤维化进程［16］。STAT6 能够促进巨噬细胞向M2 型极化以抑制动脉粥样硬化[17]。但在细粒棘球蚴上未见相关研究。因此，课题组在体外研究了感染细粒棘球蚴时STAT6 诱导的巨噬细胞极化。研究证实STAT6抑制剂可促进巨噬细胞向M1型极化。

本实验中EgCF处理巨噬细胞24 h后，STAT6和M2 型巨噬细胞相关因子IL-4、ARG1、TGF-β 表达水平升高，同时M1 型巨噬细胞相关因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表达水平降低。使用STAT6抑制剂后，M1型相关因子的表达水平均被提升，M2型相关因子的表达水平均被抑制。提示在细粒棘球蚴感染中STAT6可促进巨噬细胞表型向M2型极化。

综上所述，课题组猜测细粒棘球蚴促进STAT6表达，使巨噬细胞向抑炎的M2 型极化，因此课题组采用STAT6 抑制剂抑制了STAT6 的表达，发现其可减少EgCF 诱导的M2 极化，可能对逆转EgCF 的免疫逃逸具有重要作用。本研究也揭示了STAT6 可能作为治疗细粒棘球蚴感染的一个新靶点。