重组溶瘤腺病毒联合纳米粒子对HepG2细胞毒性的作用①

郭楚君，孙玉鸿，李 升

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

癌症，又称为恶性肿瘤，是由病人自身产生的、可以进行无限增值的、并由身体一个部位转移到其他部位的一种疾病，是危害人类健康最严重的疾病之一[1,2]，肝癌又是恶性肿瘤中最常见的一种。近年来对纳米粒子和溶瘤腺病毒在治疗肿瘤方面的研究越来越多[3～7]，它们具有许多的优越性，将两者联合起来，则会取得更大的抗肿瘤效果。

100多年前就有人尝试用野生型病毒来治疗癌症，说明这种野生型病毒对肿瘤细胞具有一定的抑制作用[8]。现在人们可以对病毒基因进行定向操作和改造，删除某些致病基因或利用肿瘤特异性启动子控制病毒肿瘤特异性复制，满足治疗的需要[9]。与传统化学药物治疗肿瘤相比，溶瘤治疗最大的优势在于病毒对正常人体细胞的影响较小[10]。所以利用溶瘤病毒来治疗肿瘤从理论上具有更高的效率和更低的毒副作用。而纳米粒子作为运载体，也在多方面发挥其优势，例如纳米材料尺寸小、比表面积大、易修饰、生物相容性好等，大大提高了溶瘤腺病毒在病变组织的靶向富集和可控性释放的精确度，降低了对正常组织的毒副作用[11]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料：纳米粒子来源于国家纳米中心，HepG2、HL-7702细胞来源于佳木斯大学生命科学实验中心，重组溶瘤腺病毒来源于百恩维生物科技有限公司。

1.1.2 仪器：倒置式生物显微镜(CKX41 OLYMPUS) ，台式离心机(TDL-50B)，电热干燥箱 (DHG-9246A )，冰箱 (Sanyo)，电恒温水浴锅(HWS28 )，CO2培养箱(E191IR/W200IR)，酶标仪 (BioTek)。

1.1.3 药品试剂：96孔板 、离心管 、培养瓶(Corning、Costar)公司，MTS试剂(Promega)，DMEM培养基 、胰酶 (Gibco)、无水乙醇购自天津市凯通化学试剂有限公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重组溶瘤腺病毒的构建

使用hTERT 启动子替代原始启动子，然后在启动子核心序列内插入3个 E-box 序列，可以增强启动子的靶向性。

1.2.2 重组溶瘤腺病毒纳米系统的构建

重组溶瘤腺病毒纳米系统是通过带负电的溶瘤腺病毒DNA和带正电的纳米粒子之间相互吸附的自组装行为而形成不同粒径聚集体的。基本的方法是将两种带不同电荷的物质分别溶于溶质中形成两种溶液，迅速混合两种溶液，经过搅拌之后静置，形成较为稳定的溶液状态。

1.2.3体外验证重组溶瘤腺病毒纳米系统对HePG2细胞的毒性作用

1.2.3.1使用MTS方法检测重组溶瘤腺病毒纳米系统对HePG2的毒性作用

体外培养的HepG2细胞(培养基为DMEM，含10% 胎牛血清，1.2%青霉素和链霉素双抗，培养温度为37℃，二氧化碳浓度5%)分别用PBS洗2遍，胰酶消化，细胞计数板计数，稀释至5×104个细胞每毫升，将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔接种100μL(约1×104个细胞)；DMEM培养基中培养24h。吸去每孔中的培养液，加入100μL含不同浓度(50μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)重组溶瘤腺病毒纳米系统的培养基，每个浓度4个平行样品，继续培养至预定时间(24h、48h)；同时做只有纳米材料的对照组。每孔加入20μL含MTS(CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)试剂，37℃静置1h。全自动酶标仪(BioTek)于490nm波长检测溶液吸光值，实验重复3次，绘制不同浓度下不同作用时间的细胞生长曲线。

1.2.3.2流式细胞仪测定重组溶瘤腺病毒纳米系统对HePG2细胞的毒性

体外培养的HepG2细胞用PBS洗两次，胰酶消化；细胞计数板计数后，接种于12孔细胞培养板，每孔接种1.5mL培养基(约1×105个细胞)，培养24h。吸去每孔中的培养液，PBS清洗2遍，每孔加入含不同浓度(26.6μg/mL、21.3μg/mL、16μg/mL、10.6μg/mL、5.3μg/mL)重组溶瘤腺病毒纳米系统的DMEM培养基1.5mL，同时做只有纳米材料的对照组。每个浓度设置3个平行样品。在培养24h和48h后，胰酶消化，培养液1000rpm离心5min收集细胞；将每孔收集到的细胞用PBS重悬；流式细胞仪检测细胞凋亡，绘制曲线。

2 实验结果

2.1 MTS方法检测重组溶瘤腺病毒纳米系统对HePG2细胞的毒性作用(重组溶瘤腺病毒质粒联合纳米粒子：NPs-质粒；空载纳米粒子：NPs)重组溶瘤腺病毒纳米粒子对于细胞生长的抑制

实验结果表明:(1)重组溶瘤腺病毒纳米粒子对于肝癌细胞HepG2生长有明显的抑制作用，并且随着浓度的增加，肝癌细胞的生存率逐渐降低。当最大浓度50μg/mL时，作用48h后，肝癌细胞的生存率仅为22%。(2)重组溶瘤腺病毒纳米粒子作用48h后，对肝癌细胞HepG2的生长抑制作用要明显要强于24h。(3)纳米粒子NPs对肝癌细胞HepG2没有明显的毒性作用，当NPs为最大浓度50μg/mL时，肝癌细胞的生存率可以达到84%。见图1。

图1 HepG(A:24h，B：48h)被不同浓度的重组溶瘤腺病毒质粒和NPs作用后的细胞存活率-药物浓度曲线(P<0.01)

2.2 流式细胞仪检测HePG2细胞的凋亡

流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡，实验结果表明含纳米粒子可诱导肝癌细胞HepG2的凋亡，且存在时间和浓度依赖性，浓度越高，细胞的凋亡率越高，细胞的生存率越低。并且培养48h后对肝癌细胞的生长抑制作用明显高于24h。当重组溶瘤腺病毒纳米粒子的浓度为26.6μg/mL，培养48h后，肝癌细胞的生存仅为26.7%。见表1～2。

表1 纳米粒子作用24h后的细胞凋亡结果

表2 纳米粒子作用48h后的细胞凋亡结果

3 讨论

传统的化学药物治疗肿瘤对正常组织或器官会产生毒副作用，给患者带来极大的痛苦，很大程度上降低了患者的生活质量。溶瘤腺病毒对肿瘤细胞具有复制选择性、hTERT启动子在肿瘤细胞与正常细胞中的活性有差别、纳米粒子具有靶向性，均具可以增强肿瘤的特异性，将三者联合建立多重肿瘤特异性，可以减少对正常细胞的感染率，实现对肿瘤细胞的特异性识别和杀灭。所以本文的实验方法为肿瘤细胞的治疗提供新的研究思路和理论依据。