远志皂苷元对Aβ25-35致伤PC12神经元样细胞突触可塑性的影响①

杨庆铎，赵锦程，朱晓峰

(1.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

AD多发生于老年及老年前期，其主要病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生。发病的主要特征有进行性的认知功能障碍等。临床表现为记忆障碍、失语、失用、抽象思维、人格以及行为改变等。AD的发病机制与衰老密切相关。目前主要有Aβ假说、tau蛋白假说、炎症假说和神经保护假说等。Aβ被认为是各种原因诱发阿尔茨海默病的共同通路，是AD形成和发展的关键性因素[1]，其大量聚集的现象，被认为是对神经细胞、胶质细胞的突触、线粒体产生严重损伤的元凶之一，且Aβ大量沉积亦被认为是AD的经典病例特征之一[2]。中药远志，是我国重要的常用中草药之一，具备安神醒脑、祛痰、消肿的功效，被视作“养命要药”[3]，多用于治疗心肾不交引起的失眠多梦、健忘惊悸、神志恍惚等症状。SEN为远志主要皂苷类化合物之一。研究表明，远志皂苷具备镇静催眠、改善学习记忆、抑菌抗炎、抗抑郁、抗衰老以及保护心脑血管等多种生物活性[4，5]。

因此，本项目旨在采用PC12细胞诱导分化为神经元样细胞，经Aβ25-35致伤建立AD体外模型，探讨SEN对AD的影响。通过检测SEN对Aβ25-35致伤PC12神经元样细胞可以反映突触可塑性的三种相关蛋白PSD-95、Syn、ERK1/2的mRNA及蛋白表达的影响，探讨SEN干预AD的可能机制，为阿尔茨海默病的治疗提供新的靶点和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

远志皂苷元标准品购自北京Solarbio公司；PC12细胞购自沈阳万类生物公司；Aβ25-35寡聚体购自北京Bioss公司；脑源性神经生长因子购自武汉ProSpec-Tany公司；神经生长因子购自北京孚博生物公司。

1.2 实验方法

使用含有浓度50ng/mL的NGF的1640完全培养基培养细胞4～5d后，使PC12细胞分化为神经元样细胞。将分化后的PC12神经元样细胞接种到含Aβ25-35寡聚体浓度为10μmol/L的1640完全培养基的六孔板中，致伤细胞48h，建立AD模型，分别设为模型组(B组)、BDNF对照组(C组)、SEN低剂量组(D组)、SEN高剂量组(E组)。

空白对照组(A组)加入生理盐水的完全培养液；模型组(B组)处置同A组；BDNF对照组(C组)加入含BDNF浓度50ng/mL的完全培养液；SEN低剂量组(D组)加入含浓度25μmol/L SEN的完全培养液；SEN高剂量组(E组)：加入含浓度50μmol/L SEN的完全培养液。

2 结果

2.1 MTT法检测各组细胞的存活率

10μmol/L的Aβ25-35寡聚体作用48h后，A组(空白对照组)、B组(模型组)、C组(BDNF对照组)、D组(SEN低剂量组)和E组(SEN高剂量组)OD值分别为0.394±0.062、0.188±0.024、0.333±0.052、0.232±0.035和 0.282±0.036。模型组的细胞存活率明显低于空白对照组(P<0.01)。同时，SEN低剂量组、SEN高剂量组的细胞存活率要明显的高于模型组(P<0.05，P<0.01)。BDNF对照组、SEN低剂量组、SEN高剂量组各组间比较，细胞存活率差异无显著性(P>0.05)。

2.2 RT-PCR法检测各组细胞相关蛋白mRNA的表达

模型组细胞PSD-95mRNA、SynmRNA及ERK1/2mRNA的表达明显低于空白对照组(P<0.01)，BDNF对照组、SEN低剂量组及SEN高剂量组PSD-95mRNA、SynmRNA、ERK1/2mRNA的表达明显高于模型组(P<0.05)，且SEN高剂量组PSD-95mRNA、SynmRNA、P-ERK1/2mRNA的表达明显高于SEN低剂量组(P<0.01)。见表1。

2.3 Western blot法检测各组细胞相关蛋白的表达

模型组细胞PSD-95、Syn及P-ERK1/2的表达明显低于空白对照组(P<0.01)，BDNF对照组、SEN低剂量组及SEN高剂量组PSD-95、Syn、P-ERK1/2的表达明显高于模型组(P<0.05)，且SEN高剂量组PSD-95、Syn、P-ERK1/2的表达明显高于SEN低剂量组(P<0.01)。见表1，图1。

表1 PSD-95、Syn及ERK1/2mRNA及蛋白表达情况

图1 3种蛋白Western blot检测

3 讨论

突触可塑性与PSD-95密切相关，具有接受、整合突触信号并将其传导给突触后细胞的功能分子装置，在突触可塑性中发挥着重要的作用。有研究发现，轻度认知功能损伤患者的海马PSD-95水平明显下调[6]；AD模型大鼠海马CA1区PSD-95表达明显下调。提示PSD-95表达异常可能与AD的发病有关[7,8]，PSD-95表达水平与AD早期认知功能改变有关。

突触素(Syn)是分布在突触前囊泡膜上的钙结合酸性糖蛋白， Syn的分布和密度可间接的反映突触的数量和传递效能[9]。通过影响突触结构以及磷酸化作用，调控乙酰胆碱、谷氨酸等神经递质的释放。Syn对突触可塑性的调节表明其与脑功能活动关系密切。AD模型大鼠海马区Syn表达减少。同时，突触密度下降，神经元突触的联系减少，导致胆碱能神经元递质释放减少，学习记忆能力减退。

细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的一员[10]。ERK可活化海马CA1区NMDA受体非依赖型LTP，部分皮层神经通路的LTP等亦需要ERK的活化[11]，表明ERK可参与多种形式的突触可塑性和学习记忆过程。

本研究发现，模型组细胞PSD-95mRNA、SynmRNA及ERK1/2mRNA的表达及蛋白表达明显低于空白对照组(P<0.01)，BDNF对照组、SEN低剂量组及SEN高剂量组PSD-95mRNA、SynmRNA、ERK1/2mRNA的表达及蛋白表达明显高于模型组(P<0.05)，且SEN高剂量组PSD-95mRNA、SynmRNA、P-ERK1/2mRNA的表达及蛋白表达明显高于SEN低剂量组。证明以浓度为10μmol/L的Aβ25-35作用于细胞48h后，PC12神经元样细胞受到明显损伤，SEN能对Aβ25-35致伤PC12神经元样细胞产生明显的保护作用，显著改善其突触可塑性，且SEN高剂量组的效果优于低剂量组。SEN对抗Aβ25-35损伤的机制可能与影响突触可塑性功能蛋白PSD-95、Syn、P-ERK1/2的表达有关，但具体机制尚需后续深入研究论证。