乳粉中1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油三酯的测定

刘春霞，段国霞，刘丽君，陈素敏，李翠枝*，吕志勇

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

对婴幼儿来说，母乳是生长发育过程中最理想的食物来源。乳脂肪作为母乳的重要成分之一，虽然仅占母乳的3%～5%，却能提供50%～60%的能量，也提供必需脂肪酸、脂溶性维生素和生物活性物质，是婴儿成长所需能量的主要来源[1-2]。乳脂肪中甘油三酯大部分都是U-S-U结构（U代表不饱和脂肪酸，S代表饱和脂肪酸）[3-7]，这与大部分植物油的构型显著不同[8-12]。人乳脂的组成和结构比较特殊，从人乳脂脂肪酸组成来看，主要包括油酸、棕榈酸和亚油酸，分别占人乳脂的5%～35%、20%～30%、10%～20%[13-14]。因此。由这3种脂肪酸通过一定方式生成的1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油三酯（1-oleic-2-palmitic-3-linoleic acid triglyceride，OPL）为U-S-U结构[15-18]，这种独特的结构可促进婴儿对脂肪和钙的吸收，并对脂代谢有显著影响[19-22]。夏袁[23]分析我国无锡地区309 份不同哺乳时期母乳的甘油三酯组成，发现OPL含量最高，可达23.24%～28.34%。OPL约占母乳脂中甘油三酯含量的25%，是中国母乳中含量最丰富的甘油三酯之一，婴儿配方乳粉是婴儿最理想的人乳替代食品[24-26]。

牛乳是婴幼儿配方乳粉的重要原料，而它与母乳相比吸收率较低，主要因为牛乳脂肪中棕榈酸的位置分布主要在sn-1和sn-3位酯化，sn-2棕榈酸酯占35%，远低于母乳中sn-2棕榈酸酯含量。为使这些婴幼儿获得与母乳相似的营养，就需要对牛乳脂肪进行结构化改造，或采用结构油脂，使其甘油三酯的脂肪酸组成更接近母乳[27-30]。所以，有必要开发一种能够满足添加OPL乳粉的检测方法。

本研究主要针对乳粉基质，采用CP-TAP CB弹性石英毛细管柱进行分离，氢火焰离子化检测器测定OPL的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳粉：市场随机抽取共6 种样品。

标准物质：OPL标准品（C55H100O6，纯度≥99%）北京曼哈格生物科技有限公司；石油醚（分析纯）、乙醚（分析纯）、无水乙醇（分析纯） 天津市富宇精细化工有限公司；氨水（优级纯）、氢氧化钾（分析纯）天津盛奥化学试剂有限公司；正庚烷（色谱纯） 天津光复精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B气相色谱仪（配备氢火焰离子化检测器）美国安捷伦公司；AL204分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；SuperVario-N多功能离心机 德国Funke Gerber公司；Pro UV超纯水机 美国赛默飞世尔公司；DZKW-4电热恒温水浴锅 北京兴伟仪器有限公司；MS 3 basic涡旋振荡器、RVID旋转蒸发仪 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 试样制备

1.3.1.1 样品水解称取乳粉试样约1.0 g至毛氏抽脂瓶中，加入10 mL（65±5）℃的水溶解试样，振摇，使样品完全溶解，加入2 mL体积分数为25%的氨水，置于60～70 ℃水浴中15～20 min，约3～5 min左右振荡1 次，取出，冷却至室温，静置30 s。

1.3.1.2 脂肪提取

加入10 mL乙醇，加入2 滴1 g/100 mL刚果红，混匀[31-34]。加入25 mL乙醚，塞上塞子按100 次/min振摇1 min。再加入25 mL石油醚，塞上塞子按100 次/min振摇30 s[35-37]。500～600 r/min离心5 min，使醚层、水层分开。倾出上清液于250 mL圆底烧瓶中，为第1次提取。第2次提取加入的试剂为5 mL乙醇、15 mL乙醚、15 mL石油醚，操作同前，离心分层后倾出上清液与第1次上清液合并。第3次提取不加入乙醇，加入15 mL乙醚、15 mL石油醚，操作同前，离心分层后倾出上清液与前2 次上清液合并。

1.3.1.3 样液浓缩

把装有合并醚液的圆底烧瓶置于旋转蒸发器上，（60±2）℃通入氮气旋转蒸发，浓缩至近干，用正己烷（或正庚烷）溶解残留物并定容至10 mL，涡旋振荡器混匀，0.45 μm有机针式滤器过滤即为待测液。

1.3.2 仪器工作条件

CP-TAP色谱柱（25 m×0.25 mm，0.10 μm）[38]；进样器温度330 ℃，分流进样，分流比1∶10，进样体积1.0 μL；氢火焰离子化检测器温度360 ℃，载气：氮气；尾吹流量（氮气）25 mL/min；程序升温：初始温度250 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升至280 ℃，以10 ℃/min的速率升至340 ℃，保持1 min，以1 ℃/min的速率升至350 ℃，保持20 min。

1.3.3 结果计算

按照下式计算样品中OPL含量。

式中：A样为样品中OPL峰面积；A标为OPL标样峰面积；ρ标为配制的OPL标样质量浓度/（mg/mL）；V为定容体积/mL；m为待测样品质量/g。

1.4 数据处理

采用Excel对所涉及到的数据和图谱进行处理和绘制。

2 结果与分析

2.1 样品处理条件优化

参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》方法进行样品制备，碱水解是利用氨水破坏蛋白质、纤维素及结合态脂类，使脂肪游离；将游离的脂肪进行浓缩，考察浓缩后是否及时定容对检测结果回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）的影响。由表1可知，浓缩后及时定容，样品回收率、重复性实验结果均符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求，如果样品浓缩后放置一段时间再定容，样品回收率和稳定性就会受到影响。

表 1 立即定容和放置20 min后定容的回收率和RSDTable 1 Recoveries and RSD obtained by making up the samples to a constant volume immediately and after 20 min of storage

2.2 色谱柱选择

选用Restek Rtx-65TG色谱柱（30 m×0.25 mm，0.10 μm）与Agilent CP-TAP CB色谱柱（25 m×0.25 mm，0.1 0 μ m）进行实验，根据《中国药典》要求，分离度需大于1.5。通过比较，Restek Rtx-65 TG色谱柱分离度达不到要求；Agilent CP-TAP CB色谱柱分离度如图1所示，实现了完全分离。因此选用Agilent CPTAP CB毛细管色谱柱。

图 1 乳粉样品中OPL色谱图Fig. 1 Chromatogram of OPL in milk powder samples

2.3 程序升温条件选择

选择好色谱柱后，程序升温条件的确立是根据《中国药典》要求，需要实现样品与杂峰的分离度大于1.5，首先设定的升温程序为：初始温度175 ℃；175～300 ℃，升温速率50 ℃/min，保持0.5 min；300～350 ℃，升温速率7 ℃/min，保持25 min。这一程序升温不能实现OPL与杂峰分离度大于1.5。通过提高初始温度，降低升温速率，实现了目标峰与杂峰的分离度大于1.5。优化后的升温程序为：初始温度250 ℃，保持1 min，250～280 ℃，升温速率20 ℃/min；280～340 ℃，升温速率10 ℃/min，保持1 min；340～350 ℃，升温速率1 ℃/min，保持20 min。

2.4 标准溶液及乳粉样品色谱图

确定最佳的样品处理条件、色谱柱及程序升温条件后，得到标准溶液和乳粉样品溶液的色谱图如图2所示。

图 2 1 100 μg/mL标准溶液（A）及乳粉样品（B）色谱图Fig. 2 Chromatograms of 1 100 μg/mL standard solution (A) and milk powder samples (B)

2.5 方法重复性

分别对不同OPL含量的乳粉进行6 次平行实验，得到6 个测定值和RSD。根据GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求，被测组分含量为1 g/100 g时，RSD≤2.7%；10 g/100 g时，RSD≤2.0%。由表2可知，OPL含量为1.12、3.67、5.45 g/100 g时，RSD分别为1.289%、1.987%、1.998%，均＜2.0%，重复性实验符合要求。

表 2 乳粉OPL含量测定结果（n=6）Table 2 Results of determination of OPL in milk powder samples (n = 6)

2.6 方法准确度

根据GB/T 27417—2017的要求，被测组分含量＞100 mg/kg，加标回收率为95%～105%。由表3可知，不同乳粉样品中OPL的加标回收率为95.2%～101.9%，准确度符合要求。

表 3 加标回收率实验结果Table 3 Recovery of OPL from spiked samples

2.7 检出限和定量限

由 表4 可 知， 乳 粉1 样 品 稀 释5 倍（ 稀 释后测定结果为0.2 g/1 0 0 g 左右）重复测定6 次结果为均能检出，信噪比为5.2 ～5.5，根据GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》大于检出限信噪比为3的规定，满足检出限要求；乳粉1样品测定结果为1.120 g/100 g，信噪比为13.4、14.2、13.6、13.8、13.9、14.0，大于定量限信噪比为10的规定，满足定量限要求。

表 4 定量限、检出限测定结果（n=6）Table 4 Determination results of LOQ and LOD (n=6)

2.8 盲样结果

由表5可知，8 种乳粉中OPL含量不同，部分乳粉中OPL含量低于检出限，说明不同乳粉产品OPL的添加量不同。

3 结 论

采用随机抽取的乳粉样品进行实验条件优化，确定最佳实验条件为乙醚和石油醚提取乳粉样品中的油脂，通过CP-TAP CB气相色谱柱分离，以氢火焰离子化检测器检测，外标法定量。结果表明，乳粉中OPL的添加量为1～6 g/100 g时，加标回收率为95.2%～101.9%，RSD为1.289%～1.998%，此方法具有较好的准确性、重复性、分离度和精密度，同时能够有效分离乳粉中的C52甘油三酯，提供了一种能准确测定乳粉中OPL的方法，对于婴幼儿配方乳粉添加OPL这一物质的检测有重要参考意义，使这些婴幼儿能获得与母乳相似的营养[39]。