铁路栅栏上接触性DNA检验方法的比较

张振清， 李晟婷， 范光耀

(1.铁道警察学院刑事科学技术系， 河南郑州 450053；2.铁道警察学院郑州市刑事科学技术重点实验室， 河南郑州 450053；3.上海铁路公安局上海公安处， 上海 201100； 4.绍兴文理学院司法鉴定中心， 浙江绍兴 312000；5.刑事检验四川省高校重点实验室， 四川泸州 646000)

0 引言

中国拥有漫长的铁路线，线路运营安全关系着国计民生[1]。铁路栅栏一直担负着维护线路安全的重要安防职责[2]，而铁路线路破坏及盗窃案件中案犯抵达作案现场通常无法回避与铁路栅栏相互接触。罗卡德定律(Locard’s principle)指出，接触即发生物质转移。受承痕体表面形状所限，要提取铁路栅栏上遗留的指纹以进行个人识别往往难度极大。与此同时，案犯与栅栏接触后也可遗留来自人体正常代谢过程中的脱落上皮细胞及汗液中的游离DNA。对此类微量接触性DNA进行检验的，可为侦查破案提供重要线索。尽管如此，由于铁路线路栅栏上遗留的接触性DNA常处于野外环境，物证难以整体提取且不易保存，且受到采样方法影响，分型成功率一直不高。本文以铁路栅栏为研究对象，从被模拟徒手攀爬过的栅栏上获取接触性DNA并进行STR分型，分别对接触性DNA的采集、提取方法和不同材质栅栏上STR(short tandem repeat，短串联重复序列)分型效果进行比较分析，以期为铁路线路破坏及盗窃等实际案件[3]中遇到的栅栏上接触性DNA检验提供重要参考。

1 材料与方法

DNA样本采集实验用栅栏，实验选取在野外处于有效运营中的铁路线路上防护栅栏，栅栏材质包括3种：铁质金属网、喷漆金属网和钢筋混凝土防护栅栏。攀爬及抓握实验实验者洁净双手1 h后，模拟攀爬动作，抓握铁路栅栏10 s，不同材质栅栏分别重复12次。以上实验共进行36次。

样本提取采用棉签两次转移法(擦拭法)[4-5]：生物物证提取棉签，滴加40 μL纯水，用该棉签在遗留有抓握痕迹处反复擦拭，干棉签擦拭相同部位，充分转移剩余细胞(如图1)，常温干燥环境中保存。脱落细胞粘取器采集法(粘取法)[6]：取出脱落细胞粘取器，小心揭开粘面保护层，用粘面在有抓握痕迹处反复粘取多次(如图1)，然后放回封存盒，常温干燥环境中保存。

图1 铁路栅栏上接触性DNA的提取

1.1 主要仪器和试剂

脱落细胞粘取器(长春市博坤生物科技有限公司)；生物物证提取专用棉签(长春市博坤生物科技有限公司)；Chelex-100Resin树脂(美国伯乐Bio-Rad公司)；Microcon®离心式超滤管(美国密理博Milipore公司)；ABI ProFlexTM热循环仪(美国Thermo Fisher Scientific公司) ;Applied Biosystems GlobalFiler STR试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司);3500系列基因分析仪(美国 Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和纯化

Chelex-100提取法剪取接触客体的棉签尖端部分适量，置于1.5 mL离心管中，加入150 μL Chelex-100悬浊液(5%)与10 μL蛋白酶K溶液(10 mg/mL)，恒温干热器上56 ℃孵育12 h，煮沸8 min，离心5 min(13 000 r/min)后，取上清液适量扩增。

Chelex-100联合Microcon纯化柱提取法(简称Chelex联合Microcon法)[7-8]重复Chelex-100法操作步骤，取Chelex-100法离心后的上清液约100 μL转入Microcon®超滤离心管中，离心4～5 min(6 500 r/min)，反转离心1 min(14 000 r/min)收集浓缩液约10 μL，取浓缩液适量扩增。

1.2.2 DNA扩增和检验

扩增按照GlobalFiler试剂盒扩增按照说明书进行，其中反应体系缩小至10 μL，模板DNA用量1 μL。扩增产物在ABI 3500 GeneticAnalyzer遗传分析仪上使用POP-4凝胶进行毛细管电泳检验。进样参数:12 s，3.0 kV。用GeneMapper®ID-Xv1.2软件对收集到的数据进行分析。

1.2.3 DNA分型结果分类

通过观察来自受试者(模拟攀爬者)STR基因座中有效等位基因数量的多少，来评估STR分型系统对该DNA提取方法的鲁棒性。各基因座等位基因峰值检测阈值为200 RFU。每个样本的等位基因检出率(Detection Rate of Alleles，DRA)可定义为，实际观察到的受试者有效等位基因个数与期望检出的全部受试者等位基因个数之比的百分数。为便于分析比较，将DRA大致划分为4组：0%、1%～49%、50%～99%、100%。应用GlobalFiler试剂盒对受试者外周血中DNA进行扩增，观察到的各基因座上全部等位基因个数为37个。

2 结果

2.1 采集方法比较

采用擦拭及粘取两种方法，分别采集栅栏表面接触性DNA(不区分栅栏材质，每种各9份)，Chelex-100法提取DNA，进行STR分型，统计每份检材检出率DRA，结果见表1。粘取法检出率有2份样本介于50%～99%，优于检出率全部小于49%的擦拭法。

表1 两种不同DNA采集方法的等位基因检出率比较

9份检材期望检出全部受试者等位基因数应为333(37×9)个，采用棉签擦拭法，实际检出61个，总检出率为18.3%；采用粘取法，实际检出99个，总检出率为29.7%。

2.2 接触性DNA提取方法的比较

对由粘取法采集的DNA(不区分栅栏材质)，分别用Chelex-100法及Chelex联合Microcon法提取并纯化DNA(每种各9份)，比较两种方法提取后的STR分型图谱中每个基因座上等位基因的峰高、峰面积及等位基因丢失率，结果见表2。

表2 两种DNA提取方法效果的比较

两种DNA提取方法分型结果的等位基因检出率情况如表3。

表3 两种 DNA提取方法的等位基因检出率比较

9份检材期望检出全部受试者等位基因数应为333(37×9)个，采用Chelex-100法，实际检出94个，总检出率为28.2%；采用Chelex联合Microcon法，实际检出68个，总检出率为20.4%，由此可知采用Chelex-100法，相比于Chelex联合Microcon法，等位基因检出率较高。然而，Chelex提取法的DNA混合现象明显，等位基因个数达到或超过3个以上的基因座高达53个，占全部基因座个数(24×9)的24.5%，而经过Microcon纯化后，检出此类基因座数量有40个，占全部基因座个数(24×9)的18.5%，分型图谱中的等位基因即杂峰相对减少。

如图2所示，同为喷漆金属网上接触性DNA分型，Chelex-100法提取的DNA所检出受试者等位基因明显多于Chelex-100联合Microcon法，但检出来自其他不明混杂成分DNA的等位基因数量也明显多于后者。可见，由于应用了Microcon进行纯化，虽然总体等位基因数量减少，混杂污染却得以大大减轻。

图2 喷漆金属网上接触性DNA分型图谱

2.3 不同材质栅栏DNA分型效果的比较

对由粘取法采集的DNA(不区分DNA提取及纯化方法)，分别对铁质金属网、喷漆金属网和钢筋混凝土防护栅栏上DNA分型效果进行比较(每种各6份)。

6份检材期望检出全部受试者等位基因数应为222(37×6)个，铁质金属网上等位基因实际检出51个，总检出率为23.0%；喷漆金属网上实际检出83个，总检出率为37.4%；钢筋混凝土防护栅栏上实际检出53个，总检出率为23.9%。相较于铁质金属网及钢筋混凝土防护栅栏，喷漆金属网上接触性DNA的DRA显然更高。

表4 3种材质铁路栅栏的等位基因检出率比较

3 讨论

本文通过实验方法比较了两种常用接触性DNA采集方法，结果显示，脱落细胞粘取器在基因座检出率可达29.7%，该方法优于棉签擦拭法。分析可能由于野外铁路栅栏附着大量灰尘、腐殖质、油脂或是铁锈等PCR抑制物，生物物证提取棉签在润湿后，将表层脱落细胞及抑制物一同采集，从而影响后期的PCR反应。脱落细胞粘取器则主要集中粘附表面脱落上皮细胞，粘附承痕体上的各类抑制物较少。同时，脱落细胞在孵育及变形过程中释放出的核酸成分能够进入溶液，而粘附的含抑制物颗粒相对不易松脱和解离，较少地进入到下一步离心扩增环节。可见，脱落细胞粘取器采集法，相比于棉签擦拭法，在铁路栅栏上接触性DNA分型效果上具有一定的优势。本研究中，在已知有抓握痕迹处进行反复用粘面粘取，是模拟接触部位已知的理想状态。尽管如此，脱落细胞粘取器采集法在实践操作中仍应十分小心，现场勘查人员应尽可能选取疑似攀爬或抓握过的部位，否则实际被粘取到的脱落细胞可能远没有带入的各类污染更多，这势必会极大影响对此类微量物证的检出率。由此看来，对潜在集中接触部位的准确预判，实际上对提取DNA的质与量都兼具影响，这需要丰富的现场勘查经验和较强的生物物证发现设备及能力。另一方面值得注意的是，应尽量控制对微量生物物证粘取的次数和力度，过大的力度和粘取次数会携带走更多的抑制物，特别是针对野外现场；而过小的力度则可能仅粘走承痕体表面附着的细微颗粒物，这些颗粒物凸起的表面体积微小，本身残留DNA的量十分有限。采用的粘取次数和力度应有一个最适范围，以最大限度提高微量DNA的检出率。然而，由于不同的承痕体及其所处的环境不同，实践中对粘取次数进行规范统一仍有较大难度，但对于微量DNA采集和提取方法的科学研究，则应尽量采用相同粘取次数和力度，以减小此类因素在组间对比时所带来的干扰。

本实验采用了Chelex-100法和Chelex联合Microcon法提取接触性DNA，实验结果表明，采用Chelex联合Microcon法得到的等位基因检出率(20.4%)要小于Chelex-100法(28.2%)。Chelex联合Microcon法所得到的STR分型图谱中峰面积的平均值(3 209.5)也要略低于使用Chelex-100法(4 119.1)。Chelex-100法提取操作流程少，最大程度上减少了模板的流失，然而其抗污染能力较差[9]。Microcon纯化法相对于磁珠法或硅珠法操作步骤简单，省时高效，常被用在法医微量、降解的生物检材提取纯化实验[10]。在对枪弹的金属和合成材料客体表面的接触性DNA研究中，Microcon纯化法有着不俗的表现[11]。本实验中，栅栏上接触性DNA经过Chelex-100法提取后，上清液中除含核酸外还含有大量抑制物，直接用于扩增效果并不理想，虽然我们能够检出的受试者等位基因相对联合法较多，但是分型图谱中却能观察到大量的来自非受试者DNA的污染情况，这对后期的分析解读极为不利。从证据证明力的角度，这样的检测结果甚至不如仅能检出较少等位基因，但混合现象却大幅改善的Microcon纯化法。

采用Chelex联合Microcon法，通过浓缩纯化能够有效去除提取到的混合DNA，减少STR分型图谱中的杂峰。从实验结果中我们可以观察到，大多数Microcon纯化后检出的等位基因都能在同一样本Chelex-100法检出的图谱中找到，这提示我们常规检案中遇到类似混杂显现明显的检材，不应轻易放弃，可结合纯化的方法进一步探究其等位基因所属个体。

从喷漆金属网上接触性DNA的STR分型图谱中可以看出，其相较于铁质金属网及钢筋混凝土防护栅栏DRA更高。分析其原因，可能由于来自铁质金属网上铁锈成分及钢筋混凝土防护栅栏上各种离子成分对PCR的抑制作用。采用粘取法仍不能有效避免将大量PCR抑制物带入后续PCR反应中，从而难以获取较为理想的DNA分型效果。为此，可设计专门针对砖石类或含铁锈检材的PCR抑制物纯化方法或PCR增强剂以应对这一难题，这也是后续研究中的努力方向。

4 结论

本文通过实验方法对铁路栅栏上接触性DNA进行检验，统计并归纳出对栅栏上接触性DNA进行采集和提取的优势方法。该研究为同行在铁路线路破坏及盗窃等实际案件中有效应对此类疑难生物检材提供参考和借鉴。