马钱苷通过内质网应激途径抑制烧伤大鼠肠上皮细胞凋亡发挥肠黏膜结构保护作用的机制

温海玲 孟祥熙 杨景哲 肖长栓

承德医学院附属医院南院区烧伤整形科（河北承德 067000）

肠损伤是重度烧伤早期最常见的器官损伤，严重烧伤可诱导肠道炎症和氧化应激，进而导致肠道屏障损伤和肠道功能障碍［1］。胃肠黏膜屏障是抵御肠道细菌、毒素等有害物质入侵的天然屏障，在多器官功能障碍综合征的发生发展中起重要作用［2］，保护肠黏膜在严重烧伤的治疗中起着重要作用。随着现代医学对中医药研究的深入，中医治疗在危重病领域发挥越来越重要的作用，从山茱萸中分离得到马钱苷属环烯醚萜类糖苷，能调节炎症因子，对抗氧化应激诱导的多种细胞凋亡，具有很好的抗炎、抗氧化能力［3-4］，但其在烧伤领域中的应用尚无报道，在烧伤治疗中的作用机制尚不明确。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）属于机体适应性调节过程，在烧伤等急性损伤后，过度的ERS 可介导细胞凋亡以及引起组织损伤［5］。本实验通过研究马钱苷对严重烧伤大鼠模型肠损伤以及ERS 途径的影响，探讨马钱苷对肠损伤的影响的相关机制，为今后进一步研究马钱苷保护肠道功能的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 成年雄性SD 大鼠（30 只），8 ～12 周龄，体质量（180±20）g，购自北京维通利华公司。大鼠置于SPF 级实验动物中心通风饲养，室内温度为（21±2）℃，相对湿度保持在40%～60%，自由饮水、进食。25 ℃条件下进行12 h/12 h 光/暗循环，饲喂标准饲料1 周。本研究经承德医学院附属医院伦理委员会审核批准（编号：LL2020028）。

马钱苷购自于武汉恒标实验科技有限公司；0.9%氯化钠注射液购自于石家庄第四制药厂；兔抗鼠双链RNA 依赖性蛋白样内质网激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、葡萄糖调节蛋白78（78-kDa glucose-regulated protein，GRP78）和C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）以及半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、B 淋巴细胞瘤-2 蛋白（B cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bax 抗体购自于美国Abcam 公司，TUNEL凋亡检测试剂盒购自于美国ROCHE 公司。PBS缓冲液、二甲基亚砜、戊巴比妥钠等均购自于Sigma 公司。分析天平购自于梅特勒托利多公司；常规手术器械购自于上海手术器械厂；离心机购自于美国Thermo 公司；冰冻切片机购自于德国Zeis；凝胶电泳系统购自美国Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 将30 只雄性SD 大鼠随机分为对照组、烧伤组和干预组，每组10 只，其中对照组连续7 d 灌胃给予50 mg/kg 生理盐水，进行假烧伤处理；烧伤组连续7 d 灌胃给予50 mg/kg 生理盐水，随后进行烧伤处理；干预组连续7 d 灌胃给予50 mg/kg 马钱苷（5 mg 马钱苷溶于1 mL 生理盐水中），随后进行烧伤处理，均为每天灌胃1 次。

1.2.2 动物模型制备 所有大鼠均采用戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔麻醉，剪除背部毛发，将大鼠放置在预制模板的矩形开口，露出裸露皮肤，同时保护剩余皮肤，根据Walker-Mason 烧伤模型，将大鼠裸露的皮肤沉浸在沸水中（100 ℃水浴，背部15 s），造成20%TBSAⅢ°烫伤（下称烧伤），烧伤后大鼠立即干燥。假烧伤对照组采用温水（37 ℃水浴，背部15 s）行背部浸泡，烧伤后大鼠立即干燥。烧伤后观察3 h/6 h，病理检查证实烧伤深度。

1.2.3 标本收集 烧伤24 h后，所有大鼠均行安乐死（戊巴比妥钠120 mg/kg，腹腔内注射），安乐死后手术切取肠组织标本，清洗干净，去除脂肪和肠系膜待用，一部分立即浸泡于10%甲醛中固定24 h，一部分装入冻存管液氮快速冰冻，-80 ℃保存备用。

1.3 评价指标

1.3.1 组织病理学检测 固定后的肠组织常规石蜡包埋，切片、苏木素-伊红染色，光学显微镜下观察肠道受损情况。

1.3.2 肠组织病理评分 每隔10张切片选择1张，对选中的切片进行组织学评分［6］。每张切片随机选取10 个高倍视野（400 倍）计分，最终计算平均值。评分包括炎症、病变、病变范围、隐窝破坏程度共4 个方面，具体评分如下［7］，炎症为0 分（无）、1 分（轻度）、2 分（重度），病变为0 分（无）、1 分（黏膜下层）、2 分（肌层）、3 分（浆膜层），病变范围为1 分（1% ～25%）、2 分（26% ～50%）、3 分（51% ～75%）、4 分（76% ～100%），隐窝破坏为0 分（无）、1 分（基底1/3 破坏）、2 分（基底2/3 破坏）、3 分（仅有完整表皮）、4 分（全部隐窝和上皮破坏）。

1.3.3 流式细胞术检测肠上皮细胞凋亡情况 肠组织用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗，收集胰蛋白酶化后肠上皮细胞，使用Annexin V-FITC/PI 检测试剂盒，按照制造商说明，通过流式细胞术评估细胞凋亡；使肠上皮细胞重新悬浮在结合缓冲液中，用Annexin V/FITC 和PI 溶液染色；使用流式细胞仪分析凋亡细胞百分比。

1.3.4 ERS 相关蛋白以及凋亡相关蛋白表达水平 采用Western blot 检测小肠组织蛋白表达水平，样本加入RIPA 裂解液（含1% 苯甲基磺酰氟）进行裂解，孵育30 min后12 000 r/min 离心10 min，上清加入5×蛋白上样缓冲液（还原型），涡旋后100 ℃× 5 min 水浴，降至室温后保存于-20 ℃，BCA 蛋白测定法测定上清液中的蛋白含量。蛋白质样品在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中溶解，在0.1% Tween 20 的三聚氰胺缓冲盐水中转移到聚偏氟乙烯膜上，5%的脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗涤3 次，再分别加入一抗PERK、GRP78 和CHOP以及Caspase-3、Bcl-2 和Bax，4 ℃过夜孵育，TBST洗涤3 次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育2 h，TBST 洗涤3 次，显色液显色，暗室下反应20 min，最后用生物凝胶图像分析系统定量分析蛋白表达水平，以β-actin 为内参，以目的条带与β-actin 条带的比值作为蛋白相对表达量

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行分析，样本量由检验效能分析结果决定，设定检验功效为0.90，检验水准α为0.05，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用成组t检验，多组比较采用方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小肠组织病理形态比较以及病理评分 对照组显示正常组织病理学，肠组织未出现苏木精和伊红染色破坏性变化；烧伤组在烧伤后24 h，表现出以肠道为特征的肠道损伤水肿、绒毛完整性丧失和炎症细胞浸润。与烧伤组相比，干预组严重烧伤的大鼠组织学炎症较少，见图1。3 组大鼠的病变、炎症、病变范围、隐窝破坏评分差异有统计学意义，其中干预组各评分低于烧伤组，高于对照组（P＜0.05），见表1。

图1 小肠组织病理学HE 染色图（×400）Fig.1 The HE staining map of rat myocardial histopathology（×400）

表1 小肠组织病理评分比较Tab.1 Comparison of histopathological scores of small intestine ±s，分

表1 小肠组织病理评分比较Tab.1 Comparison of histopathological scores of small intestine ±s，分

组别对照组烧伤组干预组F 值P 值只数10 10 10病变0.26±0.06 2.23±0.23 1.14±0.17 342.119＜0.001炎症0.14±0.04 1.74±0.23 1.02±0.21 195.375＜0.001病变范围0.52±0.16 3.46±0.47 2.33±0.32 189.117＜0.001隐窝破坏0.45±0.13 3.06±0.35 2.15±0.21 286.926＜0.001

2.2 小肠组织上皮细胞凋亡情况 流式细胞术检测以及膜联蛋白V-FITC/PI 双重染色情况显示，烧伤组的小肠组织上皮细胞凋亡情况较干预组严重，且细胞凋亡率明显高于干预组（P＜0.05），见图2、表2。

表2 细胞凋亡率比较Tab.2 Comparison of apoptosis rate ±s

表2 细胞凋亡率比较Tab.2 Comparison of apoptosis rate ±s

注：a 表示与对照组比较，P ＜0.05；b 表示与烧伤组比较，P ＜0.05

组别对照组烧伤组干预组F 值P 值只数10 10 10凋亡率（%）1.64±0.33 14.75±3.19a 9.16±2.52ab 78.046＜0.001

图2 流式细胞术检测结果Fig.2 Flow cytometry results

2.3 小肠组织凋亡相关蛋白表达情况 干预组的Caspase-3、Bax 蛋白表达量明显高于对照组，低于烧伤组，而Bcl-2 高于烧伤组，低于对照组（P＜0.05），见表3、图3。

图3 不同实验组大鼠小肠组织凋亡相关蛋白表达情况Fig.3 Expression of apoptosis related proteins in small intestine of rats in different experimental

表3 小肠组织凋亡相关蛋白表达情况Tab.3 The expression of apoptosis related proteins in small intestine ±s

表3 小肠组织凋亡相关蛋白表达情况Tab.3 The expression of apoptosis related proteins in small intestine ±s

注：a 表示与对照组比较，P ＜0.05；b 表示与烧伤组比较，P ＜0.05

组别对照组烧伤组干预组F 值P 值只数10 10 10 Caspase-3 1.05±0.23 4.24±0.57a 2.13±0.38ab 151.231＜0.001 Bcl-2 0.88±0.16 0.35±0.09a 0.66±0.12ab 44.220＜0.001 Bax 1.34±0.22 4.74±0.63a 3.68±0.52ab 126.863＜0.001

2.4 小肠组织ERS 相关蛋白表达情况 干预组的PERK、GRP 78、CHOP 蛋白表达量明显高于对照组，低于烧伤组（P＜0.05），见表4、图4。

图4 不同实验组大鼠小肠组织ERS 相关蛋白表达情况Fig.4 Expression of ERS related proteins in small intestine of rats in different experimental groups

表4 小肠组织ERS 相关蛋白表达情况Tab.4 The expression of ERS related proteins in small intestine ±s

表4 小肠组织ERS 相关蛋白表达情况Tab.4 The expression of ERS related proteins in small intestine ±s

注：a 表示与对照组比较，P ＜0.05；b 表示与烧伤组比较，P ＜0.05

组别对照组损伤组干预组F 值P 值只数10 10 10 PERK 0.52±0.07 1.14±0.25a 0.85±0.16ab 31.043＜0.001 GRP78 0.55±0.09 1.28±0.27a 0.93±0.18ab 35.265＜0.001 CHOP 0.63±0.15 0.98±0.23a 0.77±0.12ab 10.367＜0.001

3 讨论

严重烧伤可以直接或间接导致肠道致病菌的生长以及破坏肠道机械屏障，进而引发肠道细菌移位或毒素大量吸收入血，导致全身炎症反应综合征、败血症及多器官功能障碍综合征［7］。与此同时，凋亡和坏死的肠上皮细胞诱导氧化应激损伤和炎症反应，使得肠黏膜通透性增加，从而破坏肠道组织的机械屏障和免疫屏障。实验和临床研究表明肠道是多器官功能障碍综合征的始动器官，对多器官功能障碍综合征的发生、发展及转归起重要作用，同时肠道又是多器官功能障碍综合征最先受累的器官［8］，因此，肠道保护在严重烧伤的治疗中具有重要意义。马钱苷属环烯醚萜类糖苷，是山茱萸科植物山茱萸中的主要药效成分之一，研究表明山茱萸具有多种生物活性，表现出抗炎、降血糖、抗肿瘤、抗心律失常、免疫调节等作用，目前被广泛应用于抗神经退行性病变、抗血栓、抑制黑素、治疗糖尿病等方面［9-10］。另外，研究发现［11］，马钱苷还具有良好的抗氧化能力，能在体内对抗氧化应激诱导的多种细胞凋亡，而严重烧伤后肠道损伤与氧化应激损伤有关，因此推测认为马钱苷在严重烧伤中具有肠道组织保护作用。目前，马钱苷尚未应用于烧伤临床治疗，尚无马钱苷对烧伤肠道损伤保护作用的实验研究，因此本研究旨在探讨马钱苷对严重烧伤大鼠肠道损伤的影响及其具体机制，从而为烧伤患者肠道保护依据提供指导。

越来越多的研究表明，肠道上皮细胞凋亡与严重烧伤后黏膜完整性破坏和肠道屏障功能受损有关，进一步激活氧化应激和炎症，导致全身炎症反应综合征［12］。本次研究发现，烧伤大鼠预防性灌胃给予马钱苷后，烧伤后24 h 的肠道损伤情况较烧伤组明显改善（P＜0.05），同时采用流式细胞仪检测小肠黏膜细胞增殖与凋亡情况，结果显示干预组的凋亡率明显低于烧伤组（P＜0.05），表明预防性灌胃给予马钱苷可改善烧伤大鼠肠道细胞凋亡，减轻肠道损伤，从而发挥肠道黏膜保护作用。caspase-3、Bcl-2 和Bax 均是凋亡相关蛋白，其中Bax、caspase-3 促进凋亡，而Bcl-2 可抑制细胞凋亡，有研究表明Bcl-2 和Bax 等凋亡蛋白在肠黏膜损伤时处于异常表达状态，并参与肠上皮细胞凋亡的过程。本次研究发现干预组大鼠的Bax、caspase-3 表达水平明显低于烧伤组，而Bcl-2 高于烧伤组（P＜0.05），表明马钱苷可通过调控凋亡蛋白表达而抑制肠上皮细胞凋亡，从而减轻肠黏膜损伤。另外，惠毅等［13］通过给溃疡性结肠炎大鼠灌胃乌梅丸，结果显示发现乌梅丸可下调Bax 表达，促进Bcl-2 表达，从而抑制结肠上皮细胞的过度凋亡，促进结肠上皮黏膜屏障的修复，结合本次研究证实调控肠道凋亡蛋白表达可发挥良好的肠道保护作用。

严重烧伤后肠黏膜屏障损害过程极其复杂，其中严重烧伤后发生的应激反应、缺血缺氧性损害、细菌与内毒素等均是肠道屏障功能损害的重要原因，研究发现，内质网应激-自噬通路激活介导严重烧伤小鼠肠黏膜屏障功能损害过程［14］。PERK、GRP78、CHOP 均是ERS 途径相关因 子，GRP78 属于热休克蛋白家族成员，严重烧伤时GRP78 表达上调，并诱发ERS，进而上调激活凋亡基因，诱导细胞凋亡［15-16］。PERK 是发生ERS 时最先启动的通路，即内质网处于应激状态时，GRP78迅速从PERK 上解离，同时PERK 通过自身磷酸化激活，进而激活活化转录因子4，上调生长停滞及损伤基因（CHOP），诱导细胞凋亡，CHOP 也是介导ERS 凋亡的关键蛋白［17-21］。本次研究发现，大鼠肠道烧伤后ERS 相关蛋白均处于高表达状态，经马钱苷预防性干预后，PERK、GRP78、CHOP 表达水平较烧伤组大鼠明显降低（P＜0.05），表明马钱苷可下调ERS 途径，从而阻断凋亡信号通路，抑制Bax、caspase-3 的表达，改善肠上皮细胞凋亡情况，故而干预组大鼠的小肠组织学炎症较少，肠道损伤水肿、绒毛完整性丧失等病理学情况相对烧伤组较轻。此前研究发现［22］，马钱苷可通过下调TLR4/NF-κB 信号通路而减轻烧伤引起的肠道炎症和氧化应激，且相关研究［23-24］表明马钱苷可抑制氧化应激、炎症因子释放，对血管内皮细胞发挥保护作用，还能抑制糖基化的终末产物所致氧化反应，改善内质网应激，从而减轻炎症反应和细胞器损伤。结合本次研究进一步表明马钱苷可下调烧伤大鼠肠上皮细胞ERS 途径，从而减轻肠道上皮细胞凋亡，发挥肠道保护作用。此次研究仍存在不足之处，对于大鼠灌胃给药7 d 后，于造模前3 组大鼠的胃肠道状态是否存在差异尚不明确，需开展实验进行讨论。

综上所述，马钱苷可减轻烧伤大鼠肠上皮组织病理损害，保护肠黏膜结构，其机制可能与抑制肠上皮细胞ERS 途径以及减少细胞凋亡有关。