九龙藤总黄酮通过lncRNA MIAT 调控自噬对大鼠急性心肌梗死的影响

陈卉彬，简 洁

（桂林医学院药学院，广西 桂林 541199）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由于冠状动脉急性、延续性缺血和缺氧所致的心肌坏死，为临床常见的突发疾病，其死亡率较高[1]。现如今中医药对AMI 有良好的治疗效果[2]，但对现有药物的研究大多停留在药效阶段，缺乏对其作用靶点及分子机制的深入探讨。九龙藤为豆科植物龙须藤[Bauhinia championii（Benth.）Benth.]的干燥根或茎，含有丰富的黄酮类化合物，其提取物的药理作用主要体现在镇痛、抗炎、抗凝血等方面[3]。既往研究发现[4-7]，九龙藤总黄酮（Bauhinia Championii flavone，BCF）对垂体后叶素所导致的急性心肌缺血有保护作用，可激活PI3K/Akt 信号通路抗心肌缺血/再灌注损伤，并抑制自噬，减轻心肌细胞缺血/缺氧损伤。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过20 个核苷酸、缺乏蛋白质编码潜能的内源性RNA分子。lncRNA 在心血管疾病的发生、发展过程中发挥重要作用[8-11]。研究表明[12]，被称为心肌梗死相关转录本（Myocardial infarction associated transcript，MIAT）的lncRNA 可能在心肌梗死的发病机制中发挥部分作用。此外，也有研究发现[13]，敲低MIAT 表达可影响自噬，从而保护CCA 诱导的心肌肥厚，因而推测BCF 的保护作用与调节MIAT 表达抑制自噬有关。本研究通过建立大鼠心梗模型探讨BCF 通过MIAT 调控自噬对AMI 的影响，以期为防治AMI新药研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级SD 雄性大鼠50 只，体重为200～240 g，由湖南斯莱克景达动物有限公司提供[许可证号码：SCKX（湘）2019-0004]。于桂林医学院药理教研室分笼饲养,温度24 ℃～26 ℃，湿度50%～60%,12 h/12 h 明暗周期，自由进食和饮水。

1.2 材料 BCF（本室分离纯化，总黄酮含量以芦丁计为85%）；戊巴比妥钠（中国医药工业公司上海第八制药工厂，批号：71C805）；Gluta 固定液（北京索莱宝有限公司，批号：20220209）；Trizol 试剂（北京天根公司，批号：W0222）；EasyScript ○ROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技术股份有限公司，批号：O11208）；Perfect－StartTM Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技术股份有限公司，批号：P41014）；大鼠cTn-Ⅰ试剂盒（武汉华美生物公司，批号：Z21019821）；所有引物购自上海生工生物工程股份有限公司；GAPDH和Cathepsin D 抗体（Proteintech Group，批号：10020246、00058789）；LC3 抗体（Elabscience，批号：DQ0262）；超微量核酸定量仪（Thermo Scientific,型号：NanoDrop One）；实时荧光定量PCR 仪（Bio-Rad，型号：CFX96TM Real-Time System）；免疫印迹化成像系统（Bio-Rad，型号：ChemiDocTMXRS+）；小动物呼吸机（美国CEW 公司，型号：SAR-1000）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 随机选取雄性SD 大鼠，分为sham 组、AMI 组、BCF 组，除假手术组外，其余各组采用左冠状动脉前降支结扎法制备大鼠心肌缺血模型，缺血24 h 后进行lnc RNA 基因检测。设计并合成lnc RNA MIAT si-RNA，将雄性SD 大鼠分为si-NC 组、si-MIAT 组、BCF+si-NC 组和BCF+si-MIAT 组，按实验分组制备大鼠心肌缺血模型（缺血24 h）。si-NC、si-MIAT、BCF+si-NC、BCF+si-MIAT 组于造模前24 h 心肌注射MIAT 及其对照（NC）si-RNA 进行转染，BCF、BCF+si-NC、BCF+si-MIAT 组于造模前30 min 给予BCF（20 mg/kg）预处理。

1.3.2 HE 染色 造模结束后，心脏用4%多聚甲醛固定，通过梯度浓度的酒精脱水并嵌入石蜡中包埋。将包埋好的组织切成5 μm 厚的切片，在二甲苯中脱蜡，然后重新脱水，随后进行HE 染色。应用正置显微镜观察切片。

1.3.3 血清cTn-Ⅰ含量测定 造模结束，各组动物经心尖取血1 ml，10 000 r/min 离心20 min，取上清液，按大鼠cTn-Ⅰ试剂盒说明书检测血清中cTn-Ⅰ含量。

1.3.4 透射电镜 取动物心脏组织，用预冷的PBS 冲洗，切成2 mm 的立方体，4 ℃下固定过夜。乙醇梯度脱水后，进行包埋固化，随后将组织切片为90～100 nm 厚的薄片。组织染色后安装在200 目铜丝上，用JEM1200EX 透射电镜进行成像。

1.3.5 RT-qPCR 用Trizol 试剂从组织中提取总RNA，合成第一链cDNA。按照SYBR Green QPCR Master Mix 说明书进行PCR 定量。数据分析采用GAPDH 作对照基因，2-△△CT方法计算基因表达量，引物序列见表1。

1.3.6 Western blot 各组动物在造模结束后取心脏，用预冷的生理盐水充分洗净残血，取结扎线以下左心室组织，用RIPA（北京索莱宝公司）裂解总蛋白并定量，SDS-PAGE 电泳，转膜横流260 mA，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗4 ℃过夜，二抗室温孵育1 h，ECL 发光，采用Image J 软件测其灰度值。

1.4 统计学方法 应用SPSS 25.0 统计学软件进行数据处理，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素分析，组内比较采用t检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MIAT 在AMI 大鼠中的表达情况 AMI 组MIAT表达高于Sham 组，而AMI+BCF 组MIAT 表达低于AMI 组（P＜0.05），见图1。

图1 MIAT 在AMI 大鼠中的表达情况

2.2 各组大鼠心脏组织HE 染色结果分析 AMI+si-NC 组的心肌细胞减少且肥大，心肌纤维断裂且散乱排列，细胞间隙变宽；与AMI+si-NC 组比较，AMI+si-MIAT 组和AMI+BCF+si-NC 组细胞心肌细胞程度肥大减轻，排列较整齐。同时，AMI+BCF+si-MIAT组病理变化较AMI+BCF+si-NC 组有一定程度的改善，见图2。

图2 各组大鼠心脏组织的HE 染色结果（×400）

2.3 各组血清cTn-Ⅰ含量比较 AMI+si-MIAT 组、AMI+BCF+si-NC 组 和AMI+BCF+si-MIAT 血 清cTn-Ⅰ含量低于AMI+si-NC 组（P＜0.05）；同时，AMI+BCF+si-MIAT 组血清cTn-Ⅰ含量低于AMI+BCF+si-NC 组（P＜0.05），见图3。

图3 各组大鼠血清中cTn-Ⅰ含量比较

2.4 各组大鼠心脏组织自噬小体透射电镜结果分析AMI+si-NC 组自噬小体数量高于AMI+si-MIAT 组和AMI+BCF+si-NC 组，且相较于AMI+BCF+si-NC组，AMI+BCF+si-MIAT 组自噬小体的数量也有所减少，见图4。

图4 各组大鼠心脏组织自噬小体透射电镜结果（×20 000）

2.5 各组大鼠心脏组织自噬相关基因表达比较 AMI+si-NC 组Beclin1、Cathepsin D、LC3 表达高于AMI+si-MIAT 组、AMI+BCF+si-NC 组、AMI+BCF+si-MIAT 组（P＜0.05）；而AMI+BCF+si-MIAT 组Beclin1、Cathepsin D、LC3 表达低于AMI+BCF+si-NC 组（P＜0.05），见图5。

图5 各组大鼠心脏组织自噬相关基因表达比较

2.6 各组大鼠心脏组织自噬相关蛋白表达比较 AMI+si-NC 组Beclin1、Cathepsin D、LC3 的蛋白表达高于AMI+si-MIAT 组、AMI+BCF+si-NC 组、AMI+BCF+si-MIAT 组（P＜0.05）；而AMI+BCF+si-MIAT组Beclin1、Cathepsin D、LC3 的蛋白表达低于AMI+BCF+si-NC 组（P＜0.05），见图6。

图6 各组大鼠心脏组织自噬相关蛋白表达比较

3 讨论

AMI 是一种可由缺血性心脏病或冠状动脉疾病共同引起的疾病，当动脉粥样硬化斑块破裂，形成的血凝块完全或部分堵塞冠状动脉，限制了流向心脏的血液时，AMI 就会发生并伴有心源性休克等并发症，病情险恶、死亡率高[14]。在临床上，通常通过手术或冠状动脉介入来疏通堵塞的血管，以恢复心脏的血流，但由此产生的缺血再灌注损伤和手术并发症限制了治疗的整体效果。因此，需要采取有效的治疗方法。

据报道[15]，中药会影响血小板聚集、循环、氧化应激、血管反应性和其他心血管特性。中药也在AMI的治疗中积累了丰富的经验。白晓君等[16]研究发现，淫羊藿总黄酮可以PI3K/Akt/VEGF 细胞信号通路促进缺血性心肌的血管再生。九龙藤是广西的特色中药材，其性平、无毒、资源丰富，含有丰富的黄酮类化合物和皂甙，具有祛风除湿、化瘀、活血、止痛等作用。本课题组前期实验也表明[4]，BCF 对垂体后叶素所致的急性心肌缺血具有明显的保护作用。另有研究表明[17-20]，lncRNA 在心衰、心肌肥大、心肌缺血/再灌注损伤等心血管疾病中发挥着重要作用。lncRNA MIAT 是一种跨物种的lncRNA，在中枢神经系统、心脏、肺和脾脏中表达，被认为在多种疾病中发挥重要作用[21]。有报道称[22]，MIAT 的表达在缺氧细胞中上升，并与SF1 结合，抑制CGRP 的转录，促进细胞焦亡，导致AMI。同时，它还是临床诊断急性心肌梗死的潜在新生物标志物[23]。本研究建立了动物AMI 模型，RT-qPCR 检测心脏组织中MIAT 的表达，发现在体内的心肌梗死模型中，MIAT 表达上调，BCF 预处理可下调缺血心肌MIAT 基因水平。同时，沉默MIAT 与BCF 预处理可降低血清中的心肌缺血损伤的标志物cTn-Ⅰ含量，从而减轻AMI。自噬是一种代谢过程，老化或受损的蛋白质和细胞器被分解成氨基酸和脂肪酸，用于能量生产和回收[24，25]。它响应于营养缺乏或代谢应激而被激活，以维持组织功能和体内平衡[26]。许多研究已经揭示了自噬在AMI 中的功能，心脏自噬的过度激活会对急性心肌梗塞产生不良影响[27]。因此，抑制自噬可能是治疗缺血性心脏病的一个策略。实验也表明[9]，BCF 通过抑制自噬，改善心肌缺血损伤。本研究结果显示，沉默MIAT 可促进BCF 对自噬的抑制作用，如减少自噬小体的数量、下调自噬标志物LC3Ⅱ/Ⅰ比率和Beclin1、Cathepsin D 的表达，可见BCF 通过介导MIAT 影响AMI 诱导的自噬。

综上所述，BCF 预处理下调MIAT 基因表达，提示MIAT 是BCF 治疗心脏AMI 的潜在靶点。