Lnc RNA TUC338 影响人类宫颈癌细胞的蛋白组学分析

蒋漪桦，朱 宇，杜洪灵，秦锦龙，刘 晔，宋君雅，蔡骁垚，金 姝1，，4

（1.南华大学衡阳医学院，湖南 衡阳 421001；2.上海市普陀区人民医院妇产科，上海 200060；3.上海市普陀区人民医院检验科，上海 200060；4.上海市普陀区人民医院中心实验室，上海 200060）

长链非编码RNA（Lnc RNA）是一类读码框之外的RNA，近年来Lnc RNA 被发现存在多种生物功能，在癌症、免疫、神经、心血管等多种系统中存在重要作用，尤其在癌症领域的研究成为热点。在肿瘤的诊断、药物治疗的靶点、判断肿瘤预后等方面均取得进展。Lnc RNA TUC 338 长度为590 bp，位于人类第12 对染色体长臂上。对于Lnc RNA TUC 338 的研究较少，已发现在肺癌[1]、膀胱癌[2]和食管癌[3]中，Lnc RNA TUC338 均通过不同机制促进癌症发展，提示其为一种癌基因。而宫颈癌作为女性生殖系统的三大肿瘤之一，严重影响女性的生理、心理健康[4]，一定程度上也影响了两性关系的和谐[5]。Lnc RNA TUC 338 在人类宫颈癌中的相关研究较少，本研究探索了Lnc RNA TUC 338 在宫颈癌的发展中的作用及其影响宫颈癌细胞的发展的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人类宫颈癌细胞Hela 细胞购于中国科学院细胞库。胎牛血清DMEM 培养基、0.25%胰酶购于赛默飞世尔生物化学制品有限公司（北京）；磷酸盐缓冲液（PBS），购于索莱宝科技有限公司（北京）；DNA 分子量标准Ladder H1（100-1000 bp），购于生工生物工程股份有限公司（上海）；RNAfast 200 总RNA 提取试剂盒，购于飞捷生物技术有限公司（上海）；FastKing RT Kit 试剂盒、FastFire qPCR PreMix试剂盒购于天根生化科技有限公司（北京）；引物合成：生工生物工程股份有限公司（上海）；病毒包装：维诺赛生物技术有限公司（武汉）。

1.2 仪器 离心机：Eppendorf 离心机Centrifuge 5418；显微镜：重庆奥特光学仪器有限公司；荧光显微镜：Nikon ECLIPSE Ti 荧光显微镜；PCR 仪：BIORAD My Cycler；酶标仪：BioTek Synergy H1 全功能酶标仪；电泳仪：Tanon EPS 300 电泳仪；电泳设：Bio-Rad SDS-PAGE 电泳设备；凝胶成像分析系统：Tanon 1600。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与转染 将HELA 细胞以每孔1×106个置于6 孔板中，每孔加入浓度10%FBS 的DMEM 2 ml，5%CO2、37 ℃培养箱中培养，取对数生长期的细胞，每48 h 进行细胞传代，待细胞融合度达60%～70%时，按慢病毒使用说明书以脂质体法分别转染慢病毒，将HELA 细胞分为两组：转染rLVhTUC338-ZsGreen-Puro 慢病毒（实验组，以下简称TUC338 组）、转染rLV-ZsGreen-Puro 对照组病毒（对照组，以下简称rLV 组），转染48 h 后以2 μg/ml的比例加入嘌呤霉素杀灭未转染细胞，48 h 后再杀灭1 次，培养至细胞融合度达80%后进行以下各种实验。

1.3.2 RT-PCR 实验验证Lnc RNA TUC338 扩增 待细胞基本铺满板底时按照RNAfast 200 总RNA 提取试剂盒的说明书提取细胞RNA，按照天根FastKing RT Kit（with gDNase）说明书将RNA 逆转录为cDNA，按照天根FastFire qPCR PreMix（SYBR Green）试剂盒说明书，将cDNA 目的基因进行扩增，条件为：94 ℃3 min，94 ℃30 s、52 ℃30 s、72 ℃30 s循环39 次，72 ℃10 min 退火。TUC338 引物：Forward：TCAACTTAATCCCACACTGACC，Reverse：GAGCCTTGGAGACTGAACATC。以β-actin 为内参照，β -actin 引 物：Forward：CTCGCCTTTGCCGATCC，Reverse：TCTCCATGTCGTCCCAGTTG。将扩增的目的基因分别进行蛋白电泳，以1000 bpMarker为参照。

1.3.3 细胞送样及蛋白测序 将每组细胞样本分为3 个组别，送至北京诺禾致源技术公司，通过非标记定量方法（Label-free）对蛋白质酶解肽段进行质谱分析。

1.3.4 蛋白质谱分析 通过非标记定量方法（Labelfree）对2 组细胞的蛋白质酶解肽段进行定量、差异和富集分析。

1.3.5 TUC338 对蛋白基因本体功能（GO）的影响分析 分析基因本体功能（GeneOntology，GO）（www.geneontology.org），包括细胞组分（CC）、分子功能（MF）、生物过程（BP）。

1.3.6 KEGG 分析 通过Pathway 的主要公共数据库（http://www.genome.jp/kegg/）分析出已确定蛋白质参与的重要信号转导途径和生化代谢途径。

1.3.7 蛋白结构域分析 利用Interproscan 软件对蛋白质结构域分析，数据库包括Pfam、ProDom、SMART 等。

1.3.8 亚细胞定位分析 采用Cell-mPLOC 2.0 网站对测出的蛋白进行亚细胞的定位，亚细胞包括细胞核、线粒体、内质网、高尔基体、细胞膜和胞浆等。

1.3.9 蛋白互作分析 对鉴定到的蛋白进行蛋白互作分析，应用数据库http://string-db.org/（StringDB 蛋白互作数据库）。

1.4 统计学分析 使用SPSS 22.0 软件对所得到的实验结果进行统计学分析，采用t检验比较组间差异，P＜0.05 有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达TUC338 稳定细胞系和总蛋白鉴定 已筛选稳定的细胞系：荧光显微镜下见两组细胞荧光显色均为100%，慢病毒感染成功，见图1A；Lnc RNA TUC338 在实验组中的表达：经RT-PCR 实验，可见相较于对照组，实验组中的Lnc RNA TUC338 基因显著过表达，见图1B；总蛋白鉴定：对提取到的蛋白进行12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并进行考马斯亮蓝染色，两组均显示较多的蛋白条带，见图1C，提取蛋白成功。

图1 过表达TUC338 稳定细胞系和总蛋白鉴定

2.2 蛋白质谱分析

2.2.1 差异蛋白分析 蛋白定量分析共检测到4323个蛋白。蛋白差异分析显示：与rLV 组比较，在TUC338 组中下调的蛋白有194 个，上调的蛋白有225 个。以火山图（图2A）和热图（图2B）表示。其中，重要的下调蛋白有：LAMB1、HNRNPH3、COX2、FADS2、GPATCH4、CAV1、AHNAK、PFKM、MAVS、ANP32E 等。重要的上调蛋白有：EPPK1、ITPR1、AKR1C2、MFF、PTGS2、PNPLA6、AKR1B1、ITGA1、PTGFRN、TGM2 等。

图2 TUC338 影响宫颈癌细胞中蛋白差异表达的分析

2.2.2 TUC338 对蛋白基因本体功能的影响 GO 富集注释结果柱状图显示，BP 前3 位为：膀胱介导转运（vesicle-mediated transport）29 个蛋白，转运（transport）45 个蛋白、细胞内蛋白转运（intracellular protein transport）45 个蛋白；MF 前3 位为：钙离子结合（calcium ion binding）79 个蛋白、蛋白激酶活性（protein kinase activity）85 个蛋白；CC 前3 位为：细胞外区域组分（extracellular region）15 个蛋白、内质网组分（endoplasmic reticulum）17 个蛋白，见图3A；与rLV 组比较，rLV-TUC338 组中显著下调BP，包括：真空转运、细胞组分组装、自噬体组装等6 组（P＜0.05）。MF 包括：磷酸转移酶活性，醇基作为受体、细胞色素-c 氧化酶活性、激酶活性等7 组。无显著的下调CC 蛋白见图3B。与rLV 组比较，rLVTUC338 组中显著的上调BP 包括：细胞铁离子稳态、脂代谢过程、磷脂分解代谢过程等9 组。MF 包括：三价铁结合、内肽酶抑制剂活性、蛋白谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶活性等9 组。CC 包括：细胞外区域部分、细胞外空间、细胞骨架等5 组，见图3C。

图3 基因本体功能分析

图3 基因本体功能分析（续）

2.2.3 KEGG 分析 KEGG 富集注释结果柱状图显示，共注释到了包括：细胞过程，转运和代谢（Transport and catabolism）313 个蛋白、真核生物（Cellular community-eukaryotes）162 个蛋白、细胞运动（Cell motility）75 个蛋白等，共44 个KEGG 途径。其中，注释到最多蛋白的途径为代谢总谱（541 个蛋白）见图4A。显著下调KEGG 通路有半乳糖代谢（Galactose metabolism）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）等共6 个（P＜0.05），见图4B、表1。显著的上调KEGG 通路有肌动蛋白细胞骨架调节（Regulation of actin cytoskeleton）等共20 个，见图4 C，表2。

表1 KEGG 分析中重要的下调蛋白

表2 KEGG 分析中重要的上调蛋白

图4 KEGG 分析

图4 KEGG 分析（续）

2.2.4 蛋白结构域分析 结构域注释结果柱状图显示共检测到含WD40 repeat 结构域（WD40 repeat）等20 个蛋白结构域，见图5A。rLV 组和rLV-TUC338组中有显著差异的结构域包括血红蛋白过氧化酶结构域，动物（Haem peroxidase，animal）等，见图5B。

图5 蛋白结构域分析

2.2.5 亚细胞定位分析 蛋白亚细胞定位占比统计分析显示，主要亚细胞成分为：核蛋白（nucleus protein）占34.23%、细胞质蛋白（cytoplasm protein）占16.16%、线粒体蛋白（mitochondrion protein）占14.22%、内质网蛋白占8.44%；剩余由细胞膜蛋白、细胞外蛋白、高尔基体蛋白、细胞骨架蛋白、溶酶体蛋白等构成，见图6A。差异蛋白亚细胞定位占比统计分析显示，主要差异亚细胞成分为：核蛋白（nucleus protein）31 个，占24.22%、细胞质蛋白（cytoplasm protein）23 个，占17.97%、细胞外蛋白（extracell protein）20 个，占15.62%，见图6B。

图6 亚细胞定位分析

2.2.6 蛋白互作分析 在rLV 组和rLV-TUC338 组中，下调的互作网主要包括：prot1（P37268）-prot2（O95864）、prot1（Q6FGH9）-prot2（Q13363）等。上调的互作网主要包括：prot1 （P60520）-prot2（A0A024RBQ5）、prot1（P60520）-prot2（Q06330）等，见图7。

图7 蛋白互作网络图

3 讨论

差异蛋白分析发现Lnc RNA TUC338 下调了Hela 细胞的一些蛋白，从多种途径抑制肿瘤发展。其中PFKM 是糖酵解重要调节酶之一，负责催化6-磷酸果糖磷酸化为1，6-二磷酸果糖。糖代谢是支持肿瘤发展的重要代谢途径，PFKM 在多种肿瘤中呈高表达状态，比如在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中被确定为靶基因[6]。PFKM 对糖酵解的代谢重编也使乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力提高[7]。在宫颈癌中，PFKM 也存在异常高表达[8]。另一下调蛋白ANP32E即酸性核磷蛋白32 家族成员E，是一种组蛋白伴侣，负责调节各种基因的表达。已有研究证实其与乳腺癌的发生相关[9]；在甲状腺癌的研究中，ANP32E 上调激活AKT-mTOR-HK2 信号通路，增强糖酵解，促进甲状腺癌细胞增殖和迁移[10]。这些与PFKM 协同，均提示Lnc RNA TUC338 可降低糖代谢，从而抑制宫颈癌细胞的增殖。Lnc RNA TUC338 上调了一些蛋白，其中透明相关formin 1（DIAPH1）是一种激动蛋白成核酶，参与细胞骨架的调节，可与纺锤体-微管（MT）高亲和力结合，起到稳定染色体的作用[11]。这种作用机制与紫杉醇相同，且DIAPH1 可协同紫杉醇稳定微管，增加卵巢癌对紫杉醇的药物敏感性[12]。DIAPH1 的上调提示Lnc RNA TUC338 通过改变细胞骨架通路，稳定细胞状态，抑制肿瘤进展。

GO 分析发现，Lnc RNA TUC338 下调了一些GO，其中重要的下调BP 为磷酸化。磷酸化途径中的膜相关酪氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（PKMYT1）为膜相关激酶，是WEE 家族的一员，特异性磷酸化络氨酸（Tyr）15 和Thr14[13]，络氨酸的磷酸化影响代谢酶活性，使肿瘤发展[14]。另外，PKMYT1 可通过磷酸化并灭活细胞周期蛋白依赖性激酶1，调控G2/M 期之间的转换，并对DNA 进行损伤修复，导致细胞周期失控，在多种癌症中均高表达[15]。rLV-TUC338 组中重要的下调MF 为磷酸转移酶活性；其中，丝裂原活化蛋白激酶激酶2（MAP2K2）磷酸化并激活MAPK1/ERK2和MAPK2/ERK3，在MAPK 信号转导中起到关键作用，促进有丝分裂。通过抑制MAP2K1 及MAP2K2可阻断该信号转导，从而抑制细胞增殖[16]。磷酸化及磷酸转移酶活性途径的下调，提示Lnc RNA TUC338抑制肿瘤增殖的机制，可能与抑制磷酸化过程有关。

KEGG 分析发现，Lnc RNA TUC338 下调了一些KEGG 通路。KEGG 中最显著的下调信号通路为半乳糖代谢。半乳糖是细胞代谢中必不可少的单糖，参与多种生物学功能。目前研究发现越来越多的疾病涉及半乳糖代谢[17]。半乳糖糖代谢在肿瘤发展过程中亦起到重要作用。其中磷酸葡萄糖变位酶1（PGM1），具有催化葡萄糖1-磷酸（G-1-P）和葡萄糖6-磷酸（G-6-P）之间互相转化的作用，参与糖原分解及合成，被认为是一种癌基因。在肺癌中，葡萄糖剥夺状态时，AMP 活化蛋白激酶（AMPK）作为PGM1 的上游调控因子，使PGM1 表达增强，促进糖酵解，强化肿瘤代谢，促进癌细胞进展[18]。敲低PGM1可显著降低糖酵解，抑制肿瘤细胞增殖[19]。KEGG 中最显著的上调信号通路为肌动蛋白细胞骨架调节。肌动蛋白细胞骨架有多种生物学功能，包括维持细胞内钙离子稳态[20]、通过氧化还原作用调节血管细胞的迁移、增殖以及收缩[21]等。肌动蛋白细胞骨架在肿瘤细胞中对细胞迁移能力有很大影响[22]。其中磷脂酰肌醇-5-磷酸4-激酶2 型α（PIP4K2A），涉及磷酸化及细胞骨架2 个途径。在磷酸化途径中，可磷酸化5-磷酸磷脂酰肌醇，参与调节多种重要的细胞功能，包括增殖、迁移、免疫、物质运输及葡萄糖摄取等[23，24]。在细胞骨架途径中，可以维持线粒体的结构及功能稳态[25]。有研究显示[26]，PIP4K2A 为抑癌基因，其在脑胶质母细胞瘤中负向调节磷酸肌醇3-激酶（PI3K）信号传导，降解P85，从而抑制肿瘤生长。上述结果提示Lnc RNA TUC338 抑制肿瘤增殖，其机制可能与抑制半乳糖代谢及活化细胞骨架通路有关。

综上所述，Lnc RNA TUC338 改变了人类宫颈癌细胞的蛋白组学，是宫颈癌的抑癌基因。主要通过糖代谢、磷酸化、细胞骨架途径实现其抑癌作用。

致谢：感谢上海同济大学生命科学院博导、教授陆东东对本次研究的技术指导与论文撰写指导。