基于PI3K/AKT信号通路的大黄牡丹汤对急性胰腺炎大鼠肺组织细胞凋亡及炎症反应的影响

杨丹，孙银凤，白敏，宋冰，张延英，汪永锋，康万荣

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省实验动物行业技术中心，甘肃 兰州 730000

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）由多种原因引起，发病机制复杂。近年来，其发病率和病死率呈上升趋势，常出现炎症瀑布效应，导致全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征，其中以急性肺损伤最为常见，是导致患者死亡的主要原因，其病理机制主要是炎症反应与抗炎反应失调，而细胞凋亡在二者之间起到调节作用。PI3K/AKT信号通路与细胞凋亡密切相关，是AP引发肺损伤的重要信号转导通路。其通过调节肺泡上皮细胞、中性粒细胞、巨噬细胞活性，介导肺损伤发生发展。本课题组前期研究发现，大黄牡丹汤可下调AP模型大鼠血清炎症因子，改善胰腺组织病理变化，但对细胞凋亡的调控机制并不明确。因此，本研究从PI3K/AKT信号通路观察大黄牡丹汤对AP模型大鼠肺组织细胞凋亡及炎症反应的影响，明确其在AP肺损伤早期病理反应中的作用机制，为临床治疗AP肺损伤提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

2 月龄SPF 级雄性Wistar 大鼠96 只，体质量（200±20）g，甘肃中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（甘）2020-0001。饲养于甘肃中医药大学实验动物中心SPF级屏障实验室，温度21～25 ℃，相对湿度40%～45%，12 h昼夜交替，动物使用许可证号SYXK（甘）2020-0009。动物操作与处理遵循甘肃中医药大学实验动物伦理原则。

1.2 药物及制备

大黄牡丹汤（大黄12 g，牡丹皮9 g，芒硝9 g，桃仁12 g，冬瓜子30 g），饮片购于甘肃中医药大学附属医院，并由该院煎药室制备成原药材浓度为1 g/mL煎剂。醋酸奥曲肽注射液，国药一心制药有限公司，批号171003，0.5 mg/mL。

1.3 主要试剂与仪器

大鼠白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，货号分别为ml102828、ml037361、ml002859）；牛磺胆酸钠（北京Solarbio 公司，批号1111J051）；RT-PCR试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，批号H4104620）；反转录试剂盒（美国Promega公司，批号0000366052）；PI3K抗体（英国Abcam公司，批号GR3192684-9）；p-AKT、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH抗体（美国Immunoway公司，批号分别为B0601、B4101、B5501、B8501、B1501）；HE 染色剂（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号G1005）；二抗（武汉博士德生物工程有限公司，批号BST3C23C54）。微量注射泵（型号SN-50T6，深圳圣诺医疗设备有限公司）；高通量组织研磨器（型号SCIENTZ-48，宁波新芝生物科技股份有限公司）；高速低温离心机（型号5910R，德国艾本德股份公司）；电子天平（型号DF110，江苏常熟衡器工业有限公司）；超微量荧光分光光度计（型号DS-11，美国DeNovix 公司）；酶联免疫检测仪（型号Benchmark Plus，美国Bio-Rad 公司）；实时定量PCR 仪（型号CFX96，美国Bio-Rad 公司）；反转录仪（型号S1000，美国Bio-Rad公司）；电泳槽（型号JY-SPAT，美国Bio-Rad 公司）；电泳仪（型号Power PacUniversal Power Supply，美国Bio-Rad 公司）；凝胶成像分析系统（型号Chemi DOC XRS＋，美国Bio-Rad公司）；组织包埋机（型号YB-6LF，湖北亚光公司）；石蜡切片机（型号RM2235，德国Leica 公司）；光学显微镜（型号BX53F，日本Olympus 公司）；-80 ℃超低温冰箱（型号DW-86l626，青岛海尔公司）。

2 实验方法

2.1 分组及造模

96只大鼠适应性喂养1周后按体质量随机取16只作为空白组，其余80只采用胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠制备AP大鼠模型。造模前12 h大鼠禁食不禁水，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于固定板上，充分暴露腹部。备皮消毒后，沿剑突下切开，将十二指肠从腹腔取出，充分暴露胰胆管，将新鲜配制的5%牛磺胆酸钠溶液注入胰胆管，体积1 mL/kg，注射完成后，复纳十二指肠，逐层缝合关腹。将大鼠统一体位放回鼠笼，保温，禁食不禁水，密切观察其生命体征。造模后按随机数字表法将大鼠分为模型组、奥曲肽组和大黄牡丹汤高、中、低剂量组，每组16只。

2.2 干预

参考《中药药理实验方法学》换算给药剂量，奥曲肽组予0.01 mg/kg 奥曲肽背部皮下注射（相当于60 kg成人每日用量6倍），注射体积1 mL/kg，大黄牡丹汤高、中、低剂量组分别予14、7、3.5 g/kg大黄牡丹汤煎剂灌胃（相当于60 kg成人每日用量的12、6、3倍），空白组、模型组予等体积蒸馏水灌胃，分别于造模前1 h及造模后12、24 h各给药1次，共给药3次。

2.3 一般状态观察

每日观察各组大鼠精神状态、活动度、是否出现扭体反应、大便次数及便质改变等情况。

2.4 取材

末次给药1 h后，每组随机选取6只大鼠5%水合氯醛腹腔注射（0.5 mL/100 g）麻醉，心脏取血，4 ℃、3 000 r/min离心5 min，分离血清，用于生化指标检测。颈椎脱臼法处死大鼠，取出胰腺和肺脏，取右肺组织及部分胰腺组织放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色。取左肺组织迅速放入-80 ℃冰箱保存，用于ELISA、RT-PCR和Western blot检测。

2.5 生化指标检测

取大鼠血清，采用生化分析仪检测血清淀粉酶（AMS）、C反应蛋白（CRP）含量。

2.6 病理学检测

取4%多聚甲醛溶液固定的胰腺和肺组织，石蜡包埋，切片，脱蜡，HE染色，中性树胶封片，恒温箱烘烤过夜，光镜下观察并拍照。

2.7 ELISA检测

取左肺组织，加入组织裂解液，经组织研磨器研磨制备匀浆，13 000 r/min离心5 min，取上清液，采用ELISA试剂盒检测大鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量，具体步骤按试剂盒说明书进行。

2.8 RT-PCR检测

采用Trizol试剂提取肺组织总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。按反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增，以β-actin为内参，2法计算mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.9 Western blot检测

取0.1 g肺组织剪碎，加入600 μL组织裂解液（含2%PMSF），组织研磨器研磨，13 000 r/min离心5 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。取20 μg蛋白上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、封闭后，滴加PI3K一抗（1∶2 000）、p-AKT一抗（1∶500）、Caspase-3一抗（1∶1 000）、一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶5 000），4 ℃孵育过夜，洗膜，加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，采用化学发光法曝光、显影，Quantity One图像分析软件进行扫描，Image J软件计算蛋白相对表达量。

3 统计学方法

4 结果

4.1 大黄牡丹汤对模型大鼠一般状况的影响

空白组大鼠精神状态良好，二便正常，皮毛有光泽，反应灵敏；模型组大鼠眯眼倦卧，抖动，皮毛杂乱无光泽，二便减少；各给药组大鼠倦卧嗜睡、皮毛杂乱、活动度减少等状况有所改善，大黄牡丹汤高、中、低剂量组大鼠有不同程度腹泻，其中大黄牡丹汤高剂量组最为明显。

4.2 大黄牡丹汤对模型大鼠胰腺和肺组织病理变化的影响

空白组大鼠胰腺组织结构未见异常；模型组大鼠胰腺组织可见叶间隙增宽、腺泡分离，小叶结构欠完整，腺泡细胞充血，有炎性细胞浸润及坏死；各给药组大鼠胰腺组织病理变化有不同程度改善，细胞坏死、水肿及充血减少，其中大黄牡丹汤高剂量组效果最为明显。见图1。

图1 各组大鼠胰腺组织形态（HE染色，×200）

空白组大鼠肺组织无明显病理改变；模型组大鼠肺间质扩大，毛细血管充血，肺泡腔出血，水肿范围增加，炎症细胞浸润明显；各给药组大鼠肺组织病理变化有不同程度改善，间质水肿和炎性细胞浸润明显减少，其中大黄牡丹汤高剂量组效果最为明显。见图2。

图2 各组大鼠肺组织形态（HE染色，×200）

4.3 大黄牡丹汤对模型大鼠血清淀粉酶、C反应蛋白含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清AMS、CRP含量显著增加（＜0.01）；与模型组比较，奥曲肽组和大黄牡丹汤高、中剂量组大鼠血清AMS、CRP含量显著减少（＜0.01），大黄牡丹汤低剂量组大鼠血清CRP含量显著减少（＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠血清AMS、CRP含量比较（）

4.4 大黄牡丹汤对模型大鼠肺组织肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著增加（＜0.01）；与模型组比较，奥曲肽组和大黄牡丹汤高、中剂量组大鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著降低（＜0.01，＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较（，pg/mL）

4.5 大黄牡丹汤对模型大鼠肺组织PI3K、AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠肺组织PI3K、AKT、Caspase-3、Bax mRNA 表达显著升高，Bcl-2 mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，奥曲肽组和大黄牡丹汤高、中剂量组大鼠肺组织PI3K、AKT、Caspase-3、Bax mRNA表达显著降低，奥曲肽组和大黄牡丹汤高剂量组大鼠肺组织Bcl-2 mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（＜0.01，＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠肺组织PI3K、AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表达比较（）

4.6 大黄牡丹汤对模型大鼠肺组织PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠肺组织PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠肺组织PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bax蛋白表达显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（＜0.01，＜0.05）。见表5、图3。

表5 各组大鼠肺组织PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达比较（）

图3 各组大鼠肺组织PI3K、p-AKT、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白免疫印迹

5 讨论

AP属中医学“脾心痛”“腹痛”“胁痛”等范畴。中医认为，腑气不通是引起腹痛的主要病因之一，而肺与大肠相表里，腑气不通会影响肺的宣发肃降，进而出现咳嗽、气喘、胸闷等肺部表现。大黄牡丹汤载于《金匮要略》，由大黄、桃仁、牡丹皮、芒硝、冬瓜子组成。方中大黄清热解毒、泻下逐瘀，芒硝清热解毒、泻下通便，桃仁、牡丹皮凉血活血兼化瘀，冬瓜子利湿排脓散结。全方具有泻热破瘀、散结消肿功效，用于治疗热毒结于肠、气滞血瘀所致腹痛。临床研究表明，大黄牡丹汤治疗AP患者较西药常规治疗具有用药安全、疗效显著、复发率低的优势。实验研究表明，大黄牡丹汤可有效调降低AP模型大鼠炎症因子水平，促进胰腺组织修复。

肺损伤是AP最常见的早期并发症，全身炎症反应是其主要发病原因。课题组前期研究发现，大黄牡丹汤减轻炎症反应与调控Toll样受体4表达有关。Toll样受体4与内毒素、脂多糖结合后可激活NF-κB信号通路，诱导TNF-α、IL-1β、IL-6 等释放，参与炎症反应。IL-6可促进中性粒细胞活化和聚集，诱导急性炎症反应，引起肺水肿；TNF-α可以刺激细胞分泌IL-1β等炎症介质，进一步加重炎症反应；IL-1β可增加细胞对TNF-α 的敏感性，并刺激细胞释放TNF-α等细胞因子。本研究结果显示，模型组大鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量较空白组显著增加，提示AP从局部炎症反应逐步转变为全身炎症反应，进而损害其他脏器，这可能是导致AP患者出现多器官功能障碍综合征的主要原因之一。各给药组大鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量较模型组减少，胰腺组织和肺组织病理损伤有不同改善，表明大黄牡丹汤能有效减少模型大鼠炎症反应，减轻胰腺、肺组织病理损伤。

细胞凋亡在AP发病过程中扮演重要角色，主要发生于胰腺腺泡细胞和胰外器官，如肺脏、肝脏等。凋亡是细胞为维持内环境稳定发生的程序性死亡，大黄牡丹汤能使酶原物质从腺泡内转移到腺泡外，促进胰腺腺泡细胞凋亡，减轻AP所致炎症反应。目前肺损伤的细胞凋亡机制存在2种不同观点：一种认为促进中性粒细胞凋亡会降低肺损伤严重程度，即减轻炎症反应；另一种认为减少肺组织毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞凋亡可减轻肺损伤。激活PI3K/AKT信号通路可启动其下游抑凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子Bax，Caspases家族主要参与炎症反应及诱导凋亡，激活Caspase-3可提高细胞凋亡率，并导致Caspases家族其他蛋白酶级联释放。研究发现，肺损伤大鼠PI3K/AKT信号通路高表达，中药干预可通过提高Bcl-2表达、降低Caspase-3和Bax表达，减少细胞凋亡，进而减轻肺损伤。本实验结果显示，模型组大鼠肺组织PI3K、Caspase-3、Bax mRNA和蛋白表达显著升高，Bcl-2 mRNA 和蛋白表达显著降低，AKT mRNA和p-AKT蛋白表达显著升高，提示PI3K/AKT信号通路与AP肺损伤关系密切。各给药组大鼠肺组织PI3K、Caspase-3、Bax mRNA和蛋白表达不同程度降低，Bcl-2 mRNA 和蛋白表达不同程度升高，AKT mRNA和p-AKT蛋白表达不同程度降低，表明抑制PI3K/AKT信号通路能减少肺组织血管内皮细胞凋亡，从而减轻急性肺损伤病理变化。大黄牡丹汤主要成分大黄素、丹皮酚可抑制PI3K/AKT 信号通路，减少细胞凋亡，这可能是大黄牡丹汤治疗AP肺损伤的机制之一。

综上所述，大黄牡丹汤对AP模型大鼠肺组织损伤具有保护作用，可能与调节PI3K/AKT信号通路，减少肺组织细胞凋亡，减轻炎症反应有关。本实验可为大黄牡丹汤治疗AP 继发肺损伤提供实验依据和临床思路。