基于网络药理学探讨薏苡仁-苍术“异病同治”类风湿关节炎和痛风性关节炎作用机制

莫美玲，罗嗣雄，刘永芳，杨灵梅，黄秉慧，甘丽贤，陈延强

1.广西中医药大学，广西 南宁 530004；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530022

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是慢性全身性自身免疫性疾病，通常表现为局部关节疼痛、僵硬、肿胀等，其病理改变主要是慢性滑膜炎、滑膜增生、骨侵蚀等。痛风性关节炎（gouty arthritis，GA）是一种因长期高尿酸血症导致的单钠尿酸盐晶体沉积在关节腔等所致的全身性炎症性疾病，临床主要表现为局部红、肿、热、痛等，主要病理改变有滑膜炎等。

RA及GA均属中医学“痹证”范畴，且病因病机多有相似。《素问·痹论篇》“痹病，五脏亏虚为之大因”，《济生方·痹》“非独责之于风寒湿，体虚相合，痹证乃生”，强调了脏腑在痹证发病中的重要作用。《素问·至真要大论篇》言：“诸湿肿满，皆属于脾。”《脾胃论》曰：“脾病，体重即痛，为痛痹，为寒痹，为诸湿痹。”马武开教授提出RA的发病基础是脾虚湿阻经脉，认为脾虚生内湿，加之外湿困脾，内外相合，日久入络，致四肢关节疼痛，缠绵难愈。李济仁教授认为，GA属内外因杂合而致，“浊湿内蕴、经络痹阻”是其病机关键。由此可见，二者病变部位均与脾脏关系密切，病机均有脾虚湿阻经络，可能为中医“异病同治”的基础。

薏苡仁和苍术均为临床常用健脾除湿药。薏苡仁甘、淡，微寒，有健脾补中、利水消肿、渗湿除痹等功效，亦能舒筋脉，缓和拘挛，常用于湿痹而筋脉挛急的疼痛；苍术辛、苦，温，有燥湿健脾、祛风湿等功效，常用于湿阻中焦、风寒湿痹、脚膝肿痛等。如《简明医彀》苍术薏苡汤即以二者为君，具有祛风散寒、除湿通络功效。薏苡仁-苍术药对共奏燥湿健脾之功，治痹证湿胜者尤宜。郭会卿教授治疗湿痹时擅联合使用大剂量生、炒薏苡仁以健脾祛湿，常加苍术等增强健脾祛湿之功，效果显著。周芳伊分析健脾祛湿法治疗GA相关用药，其中薏苡仁、苍术使用频率分别居第1、2位。王欣妍等基于数据挖掘分析近10年RA活动期用药规律，频次排名前5位中药包括薏苡仁、苍术。薏苡仁及苍术对脾虚湿阻型RA、GA均有良好疗效，体现了“异病同治”理念。本研究通过网络药理学对薏苡仁-苍术药对“异病同治”RA及GA的相关机制进行研究，为其临床研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 薏苡仁-苍术活性成分及靶点筛选

分别以“薏苡仁”“苍术”为关键词检索TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18为条件筛选药物活性成分。通过TCMSP数据库对活性成分进行靶点预测，利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）对靶点名称进行规范并转化为基因名称。

1.2 疾病靶点收集

分别以“rheumatoid arthritis”及“gouty arthritis”“gout”为关键词，通过GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM（http://www.omim.org）数据库收集RA和GA的疾病靶点。

1.3 药物-活性成分-靶点网络构建与分析

通过Venny2.1软件分析RA、GA疾病靶点与薏苡仁-苍术药物靶点的交集靶点，利用Cytoscape3.7.1软件构建药物-活性成分-靶点网络，运用该软件Network Analyzer工具进行拓扑分析，根据节点度值（degree）判断薏苡仁-苍术治疗RA及GA的核心成分。

1.4 蛋白相互作用网络构建与分析

将药物与疾病交集靶点上传至STRING11.0（https://string-db.org/），设定物种为“Homo sapiens”，最小相互作用阈值为“medium confidence”（≥0.400），其余参数为默认值，构建蛋白相互作用（PPI）网络。以TSV格式导入Cytoscape3.7.1软件进行拓扑分析，根据靶点在PPI网络中的度值找出核心基因，度值越大代表其在PPI网络中越重要。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

运用R4.0.5软件先将基因简称（Symbol）转化为基因ID（EntrezID），然后运用R 软件的colorspace、stringi、ggplot2 包及Bioconductor 平台 的DOSE、clusterProfiler、enrichplot、pathview程序包进行GO功能富集分析与KEGG 通路富集分析，并绘制信号通路图。

1.6 中药成分-靶点-通路网络构建

将薏苡仁-苍术药对活性成分、KEGG富集分析前20条通路及对应的蛋白靶点，借助Cytoscape3.7.1软件构建中药成分-靶点-通路网络图。

2 结果

2.1 薏苡仁-苍术的活性成分及靶点筛选

通过TCMSP检索并筛选后共获得薏苡仁和苍术各9种活性成分，删除无对应靶点的活性成分，最终获得10种活性成分，分别为薏苡仁6种、苍术4种，见表1。薏苡仁、苍术活性成分对应靶点分别为42、65个，合并后删除重复靶点，共得到薏苡仁-苍术靶点70个。

表1 薏苡仁-苍术活性成分

2.2 疾病靶点

通过GeneCards数据库分别得到RA、GA相关靶点4 734、1 565个，通过OMIM数据库分别得到RA、GA相关靶点42、10个，合并后去重，分别获得RA、GA靶点4 763、1 572个。

2.3 药物-活性成分-靶点网络

将药物靶点与疾病靶点取交集，得到24个共同靶点。利用Cytoscape3.7.1软件构建药物-活性成分-靶点网络，见图1。该网络包含82个节点和117条边，节点度值越大，表明其在网络中越重要。根据网络拓扑分析结果，度值前3位的活性成分分别为Wogonin（汉黄芩素）、Stigmasterol（豆甾醇）、3β-acetoxyatractylone（3β-乙酰氧基苍术酮），其度值分别为44、29、21，这些成分可能是薏苡仁-苍术治疗RA及GA的核心成分。

图1 薏苡仁-苍术治疗RA及GA药物-活性成分-靶点网络

2.4 蛋白相互作用网络

将24个交集靶点通过STRING数据库构建PPI网络，见图2。该网络共有24个节点和136条边。对PPI网络中的靶点进行拓扑分析，筛选出度值大于中位数的基因（见图3），分别为AKT1、IL6、TNF、CXCL8、PTGS2、TP53、MAPK14、JUN、KDR、NOS2、PPARG、HSP90AA1，可能是薏苡仁-苍术“异病同治”RA及GA的核心基因。

图2 薏苡仁-苍术治疗RA及GA靶点PPI网络

图3 薏苡仁-苍术治疗RA及GA核心基因

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析结果

24个交集基因GO功能富集分析结果显示：生物过程（BP）有1 238条，主要与急性炎症反应、炎症反应的调节、活性氧代谢过程、细胞对生物刺激的反应及对脂多糖的反应等相关，见图4A；细胞组分（CC）有9条，主要包括膜筏、质膜微区、膜区域、转录调控复合物、外膜等，见图4B；分子功能（MF）有38条，涉及蛋白磷酸酶结合、DNA结合转录因子结合、丝氨酸水解酶活性、激活转录因子结合、受体配体活性等，见图4C。KEGG通路富集分析得到123条通路，主要有Toll 样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）及NF-κB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）等，见图4D。选取图中与RA及GA相关性较大的Toll样受体信号通路绘制通路图，见图5。

图4 薏苡仁-苍术治疗RA及GA靶点富集分析

图5 薏苡仁-苍术治疗RA及GA的Toll样受体信号通路

2.6 中药成分-靶点-通路网络

将薏苡仁-苍术药对活性成分、KEGG富集分析前20条通路及对应的蛋白靶点导入Cytoscape3.7.1，绘制中药成分-靶点-通路网络图，见图6。该网络反映出薏苡仁-苍术药对治疗RA及GA通过多成分、多靶点、多通路调控而发挥“异病同治”作用。

图6 薏苡仁-苍术治疗RA及GA的中药成分-靶点-通路网络

3 讨论

“异病同治”是指不同疾病在发展过程中出现相同病机时可采用相同的治法。RA及GA西医病因虽不同，但二者均有炎症反应，临床症状表现为关节肿胀、关节腔积液等，均为湿邪作祟，病机以脾虚为本。薏苡仁-苍术药对有燥湿健脾之功。现代药理研究发现，薏苡仁具有抗炎镇痛、增强免疫、调节水液代谢、抗氧化、抗肿瘤等作用，苍术具有抗炎镇静、调节免疫、利尿、抗氧化、抗肿瘤、抗肥胖等作用。

本研究运用网络药理学方法，共筛选出薏苡仁-苍术10种有效活性成分，70个作用靶点，24个药物与RA及GA交集靶点。薏苡仁-苍术的关键活性成分为汉黄芩素、豆甾醇、3β-乙酰氧基苍术酮等。研究表明，汉黄芩素有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及神经保护等作用。Huynh等发现，汉黄芩素对环氧化酶-2和前列腺素E2（PGE2）的抑制作用是急性炎症的主要分子机制，汉黄芩素还可能通过抑制Th1细胞因子和增加Th2细胞因子，从而减少炎症。Huang等研究表明，汉黄芩素通过抑制p38/MAPK和NF-κB/p65的磷酸化调节MAPK/NF-κB信号通路活性，并诱导抗氧化应激表达。豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。Gabay等研究显示，豆甾醇可抑制多种炎症介质及基质降解，且至少部分通过抑制NF-κB 通路来阻碍与软骨降解有关的MMPs的表达，同时对促炎介质PGE2产生抑制作用。苍术酮具有抗炎、抗病毒等作用，Kim等发现苍术酮可减弱caspase-1/NF-κB/MAPKs通路的激活，减少炎症因子产生。

PPI网络分析提示，薏苡仁-苍术干预RA和GA的过程主要涉及AKT1、IL6、TNF、CXCL8、PTGS2、TP53、MAPK14、JUN、KDR、NOS2、PPARG、HSP90AA1等靶基因。IL6能促进T、B淋巴细胞活化及调节炎症相关的急性期反应，被认为是炎症、免疫反应的介质。Ahsan等通过关节炎大鼠模型实验表明，使用药物抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2等促炎因子表达，可有效改善类风湿关节炎，使大鼠爪肿胀显著下降，降低ESR及CRP等指标，减缓骨侵蚀等。Dai等研究尿酸钠结晶诱导的急性GA大鼠模型发现，Tregs/Th17细胞失衡可能参与了急性GA发病，而IL-6是决定Treg/Th17平衡的关键因素，提示抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等基因是治疗急性GA发作的新策略。研究表明，GATA1通过诱导NOS2转录参与了RA的发展和恶化，导致破坏软骨等。HSP90AA1可间接阻滞NF-κB信号通路激活，减少炎性细胞因子产生，HSP90AA1靶向药物可用于治疗RA，可减少滑膜炎症和防止软骨破坏。研究表明，AKT1可参与炎症、免疫代谢和细胞增殖分化相关信号通路，在胶原诱导性关节炎小鼠中，circRNA_09505可以充当miR-6089海绵并通过miR-6089/AKT1/NF-κB轴调节炎症，显著缓解小鼠关节炎和体内炎症。MAPK家族参与炎症反应、凋亡、增殖和分化等多种细胞功能，其参与RA 发生发展已得到广泛确认。研究亦显示，MAPKs信号通路介导了GA发生与发展。p53蛋白由TP5基因编码，p53上调可能促进疾病进展中的软骨细胞凋亡，p53抑癌基因和其他关键调控基因突变的发展可能有助于将炎症转化为RA和其他炎症性疾病的慢性疾病，在RA患者的滑膜中观察到p53显著过度表达。趋化因子是趋化性促炎细胞因子，可将白细胞募集到炎症部位，在肿瘤生长、血管生成、组织硬化和自身免疫中也具有重要作用。CXCL8是CXC趋化因子家族的成员，相关实验研究表明CXCL8是RA疾病的重要危险因子。另外，无论痛风患者的疾病活动度如何，其滑液和血清中CXCL8水平均升高。

为深入了解薏苡仁-苍术对RA和GA“异病同治”作用机制，使用R 语言对交集靶点进行GO 功能及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析提示薏苡仁-苍术“异病同治”RA和GA的生物过程主要涉及急性炎症反应、炎症反应的调节、活性氧代谢过程及对脂多糖的反应等，分子功能涉及蛋白磷酸酶结合、激活转录因子结合、受体配体活性等。KEGG通路富集分析结果表明，主要涉及AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、Toll 样受体信号通路及TNF 信号通路等。AGE-RAGE信号通路可激活炎症反应和氧化应激等，如激活NF-κB，进而产生炎症因子。IL-17在各种炎症反应和自身免疫性疾病的发病机制中起着关键作用，IL-17 信号通路参与了RA 患者MMP13 的调控，从而参与了RA进程中软骨细胞的降解。Toll样受体在RA及GA等风湿性疾病的慢性炎症中起重要作用，Toll样受体信号通路大多依赖MyD88途径，从而激活NF-κB，诱导促炎因子、趋化因子等。Gong等通过胶原诱导性关节炎模型大鼠实验发现追风透骨胶囊通过TLR2/4-NF-κB信号通路调节CRP水平、ESR和RFs进而改善大鼠RA症状。段姮妃等以尿酸钠注入大鼠右后踝关节诱导GA模型并予灌胃，发现清热通络方可下调TLRs信号通路相关蛋白TLR2、NF-κB表达水平，从而阻断TLRs信号通路的激活，最终抑制炎症因子释放。

综上所述，薏苡仁-苍术治疗RA和GA的靶点及通路极为相似，通过炎症反应、免疫调节及抗氧化等多维网络调控，发挥“异病同治”作用。本研究可为薏苡仁-苍术临床治疗以脾虚湿阻为病机的RA、GA及中医“异病同治”提供依据。但网络药理学预测为理论研究，数据库收录局限可能影响其结果，且忽略了中药组分在煎煮时可能发生的化学变化，有待今后深入分析及实验验证。