不同产地山楂及其炮制品质量研究

杨晓宁，孙欣光，周丽娟，吴永剑，李建伟

1.北京振东光明药物研究院有限公司，北京 100085；2.山西振东制药股份有限公司，山西 长治 047199

山楂为蔷薇科植物山里红Bge.var.N.E.Br.或山楂Bge.的干燥成熟果实。山楂有消食健胃、行气散瘀、化浊降脂等功效。现代研究表明，山楂具有保护心血管、抗氧化、抗癌抗炎、降压、降低胆固醇等药理作用，主要含有机酸、黄酮等活性成分。2020年版《中华人民共和国药典》仅以总有机酸作为山楂化学成分含量控制指标，无法反映药材的整体质量，不能进行合理的质量评价和控制。山楂药材产地较广，不同气候、土壤及栽培条件等因素对其质量均有一定影响，因此，有必要对不同产地的山楂质量进行评价。

中药在炮制过程中化学成分会发生变化，进而导致炮制后功效改变。临床多用山楂炮制品炒山楂和焦山楂消食导滞，其中焦山楂作用较强，常用于肉食积滞、泻痢不爽。已有报道山楂在炮制过程中的化学成分变化，但多关注总有机酸含量。

本研究建立山楂中有机酸成分枸橼酸及黄酮类成分金丝桃苷HPLC含量测定方法，并结合总有机酸含量，评价不同产地山楂及其炮制品化学成分含量变化，以期阐明产地及炮制对山楂质量的影响，为临床应用提供依据。

1 仪器与试药

安捷伦1260分析型高效液相色谱仪（DAD检测器、柱温箱、自动进样器，Empower Pro色谱工作站），安捷伦科技有限公司；Waters 2695分析型高效液相色谱仪（UV检测器、柱温箱、自动进样器，Empower Pro色谱工作站），Waters公司；KQ-500DB数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；0.22 μm微孔滤膜，天津市津腾实验设备有限公司。

枸橼酸对照品（批号100396-201603，含量以100.0%计）、金丝桃苷对照品（批号111521-201708，含量以95.1%计），中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇（色谱纯），默克两合股份有限公司；甲醇、乙醇、冰醋酸、磷酸（分析纯），北京化工厂；水为超纯水。山楂药材与饮片经北京振东光明药物研究院秦文杰研究员鉴定，为蔷薇科植物山里红Bge.var.N.E.Br.的干燥成熟果实，来源信息见表1。

表1 山楂样品来源信息

2 方法与结果

2.1 枸橼酸含量测定

2.1.1 色谱条件

采用Waters X Select HSS T3 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5µm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，100%～99%B；10～16 min，99%～94%B；16～50 min，94%～85%B），柱温35 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL，检测波长210 nm。色谱图见图1。

图1 山楂中枸橼酸HPLC图

2.1.2 对照品溶液制备

取枸橼酸对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加色谱甲醇制成每1 mL甲醇中含枸橼酸0.326 8 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备

取山楂粉末（过5号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声提取（功率500 W，频率40 kHz）20 min，用50%甲醇补足减失的质量，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.4 精密度试验

取山楂粉末（过5号筛），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，结果枸橼酸的峰面积RSD＝0.29%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验

取山楂粉末（过5号筛），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，枸橼酸的峰面积RSD＝0.36%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.6 重复性试验

取山楂粉末（过5号筛），平行6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，结果枸橼酸峰面积RSD＝1.86%，表明方法重复性良好。

2.1.7 线性关系考察

取枸橼酸对照品溶液，加甲醇稀释至不同浓度，按“2.1.1”项下色谱条件检测，以浓度（mg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，枸橼酸回归方程为＝624 989－7 941.3，＝0.999 6，线性范围为0.10～0.75 mg/mL。

2.1.8 检测限与定量限

将枸橼酸对照品溶液进一步稀释成一定浓度，精密吸取上述对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录信号强度与噪音强度的比值，将信号强度和噪音强度之比为3时的浓度作为检测限，将信号强度与噪音强度之比等于10时的浓度作为定量限。枸橼酸的检测限为3.984µg/mL，定量限为9.960µg/mL。

2.1.9 加样回收率试验

取山楂粉末（过5号筛）0.1 g，精密称定，平行6份，取已知含量的枸橼酸对照品溶液，按照样品含量的100%加入样品中，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，计算山楂中枸橼酸的加样回收率，结果见表2。加样回收率为95.78%～99.61%，RSD＜2.0%，表明方法准确度良好。

表2 枸橼酸加样回收率试验结果

2.2 金丝桃苷含量测定

2.2.1 色谱条件

采用KromasiL 100-5-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5µm）；流动相A为0.1%磷酸乙腈，B为水，梯度洗脱（0～12 min，11%A；12～15 min，11%～16%A；15～27 min，16%～20%A；27～35 min，20%～27%A；35～40 min，27%～60%A）；柱温35 ℃，流速1 mL/min，检测波长352 nm。色谱图见图2。

图2 山楂中金丝桃苷HPLC图

2.2.2 对照品溶液制备

取金丝桃苷对照品适量，精密称定，置具塞容量瓶中，加色谱甲醇制成每1 mL甲醇中含金丝桃苷为4.8µg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备

取山楂粉末（过5号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，称定质量，超声提取（功率500 W，频率40 kHz）20 min，用75%甲醇水补足减失的质量，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.4 精密度试验

取山楂粉末（过5号筛）按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，结果金丝桃苷的峰面积RSD＝0.61%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验

取山楂粉末（过5号筛）按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，结果金丝桃苷的峰面积RSD＝0.89%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.6 重复性试验

取山楂粉末（过5号筛），平行6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，结果金丝桃苷的峰面积RSD＝0.90%，表明方法重复性良好。

2.2.7 线性关系考察

取金丝桃苷对照品溶液，加甲醇稀释至不同浓度，按“2.2.1”项下色谱条件进行检测，以浓度（mg/mL）为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，金丝桃苷回归方程为＝624 989－7 941.3，＝0.999 6，线性范围为0.46～17.38 mg/mL。

2.2.8 检测限与定量限

将金丝桃苷对照品溶液进一步稀释成一定浓度，精密吸取上述对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录信号强度与噪音强度的比值，将信号强度和噪音强度之比为3时的浓度作为检测限，将信号强度与噪音强度之比为10时的浓度作为定量限。金丝桃苷的检测限和定量限分别为0.09µg/mL和0.04µg/mL。

2.2.9 加样回收率试验

取山楂粉末（过5号筛）0.5 g，精密称定，平行6份，取已知含量的金丝桃苷对照品溶液，按照样品含量的100%加入样品中，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，计算山楂中金丝桃苷的加样回收率，结果见表3。加样回收率为95.85%～100.04%，RSD＜2.0%，表明方法准确度良好。

表3 金丝桃苷加样回收率试验结果

2.3 有机酸含量测定

取山楂粉末1 g，精密称定，精密加水100 mL，室温浸泡4 h，时时振摇，过滤，精密量取续滤液25 mL，加水50 mL，加酚酞指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）滴定，即得。每1 mL滴定液（0.1 mol/L）相当于6.404 mg枸橼酸。

2.4 样品测定

2.4.1 不同产地净山楂样品含量测定

不同产地山楂样品测定结果见表4。不同产地净山楂药材中有机酸含量为5.34%～13.05%，均符合2020年版《中华人民共和国药典》（一部）“山楂”项下相关要求（有机酸不得少于5.0%）。枸橼酸含量为3.41%～9.47%，金丝桃苷含量为83.03～224.74 μg/g。

表4 不同产地山楂含量测定结果

2.4.2 山楂不同炮制品含量测定

山楂不同炮制品炒山楂和焦山楂样品测定结果见表5。炒山楂中有机酸含量为5.29%～9.82%，均符合2020年版《中华人民共和国药典》（一部）“山楂”项下相关要求（有机酸不得少于4.0%）。炒山楂中枸橼酸含量为2.42%～7.50%，金丝桃苷含量为57.32～137.60 μg/g。焦山楂中有机酸含量为4.05%～8.91%，均符合2020年版《中华人民共和国药典》（一部）“山楂”项下相关要求（有机酸不得少于4.0%）。焦山楂中枸橼酸含量为1.10%～5.33%，金丝桃苷含量为7.46～103.20 μg/g。

表5 山楂不同炮制品含量测定结果

3 讨论

本研究建立枸橼酸和金丝桃苷含量测定方法时，由于枸橼酸与金丝桃苷的化合物极性和HPLC色谱保留行为存在较大差异，故分别建立2种化合物的HPLC含量测定方法。同时，本研究系统考察了不同提取方法，以及提取溶剂和提取时间等参数对枸橼酸和金丝桃苷提取效率的影响，最终确定山楂药材枸橼酸含量测定的最优提取方法为50%甲醇溶液超声提取20 min，金丝桃苷含量测定的最优提取方法为75%甲醇溶液超声提取20 min。

本研究建立了枸橼酸和金丝桃苷的含量测定方法，结合药典法测定有机酸含量，并对不同产地山楂药材及不同炮制品进行质量评价。研究结果表明，不同产地的山楂药材化学成分存在差异，其中山西和山东产地的山楂中枸橼酸、金丝桃苷和总有机酸高于其他产地，表明这2个产地的药材质量较好。不同产地枸橼酸含量规律与总有机酸含量相同，枸橼酸含量占山楂药材总有机酸含量的70%左右，是含量较高的有机酸，而金丝桃苷是山楂中的主要黄酮类成分。因此，可以将枸橼酸和金丝桃苷作为质控指标进行山楂药材的质量控制。

山楂炮制后化学成分会发生变化，本研究同时以有机酸、枸橼酸和金丝桃苷含量为指标评价山楂炮制品炒山楂和焦山楂中化学成分的变化。结果表明二者的有机酸低于原山楂药材，说明炮制过程中有机酸含量降低，与以往研究结果一致。枸橼酸作为主要的有机酸，在炮制过程中含量也降低。有机酸在炮制过程中含量下降，可减弱对胃的刺激，增强消食作用。山楂主要功效成分金丝桃苷在炮制品中含量降低，可能由于炮制加热过程使黄酮类成分发生降解。山楂药材炮制过程发生的化学成分的变化，是否会引起其药效的不同目前仍不明确，需要进行深入研究以阐明其药效与炮制的关系。

本研究建立的枸橼酸、金丝桃苷HPLC含量测定方法简便、结果可靠，可以作为质控方法进行山楂药材及其炮制品的质量评价，并为山楂质量控制及临床应用提供依据。