正交试验法优化马齿苋水提工艺

杨海涵，唐华侨，吴学渊，胥世洪，房春林通信作者

(1.成都乾坤动物药业股份有限公司，四川 成都 611130；2.四川农业大学，四川 成都 611130；3.成都农业科技职业学院，四川 成都 611130)

0 引言

马齿苋在《中国兽药典》二部中收载[1]，具有清热解毒，凉血止痢的功效。现代药理研究发现，马齿苋具有抗菌、抗病毒和提高免疫能力的作用，在兽医临床上也得到了广泛应用。研究发现多糖是马齿苋的主要成分。因此，制定了以多糖为提取指标的马齿苋水提物制备方案，为马齿苋制剂的进一步研发提供了参考[2-7]。

1 试验仪器与材料

UV-1800-PC型紫外-可见光分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；3000B型旋转蒸发仪，上海越众仪器设备有限公司；CPA225D电子天平，赛多利斯(北京)有限公司。

马齿苋，产地四川，成都吉安康药业有限公司，批号20200501，符合《中国兽药典》2020年版二部有关项的规定；D-无水葡萄糖对照品，中国食品药品检定研究院，含量以100%计，批号110833-200904；其他试剂为分析纯。

2 试验方法与结果

2.1 多糖含量测定方法

参照《兽药质量标准》中黄芪多糖的含量测定方法并结合文献报道拟定[8-12]，进行含量测定方法验证：精密度试验结果为RSD为0.86%<2%，重复性试验结果为RSD 0.77%<2%，回收率试验结果为平均回收率100.35%，RSD 1.16%<2%，稳定性试验结果为显色后的样品在2.5 h内吸光度变化不大，RSD<2%，用于马齿苋多糖的含量测定。

2.1.1 标准曲线绘制

精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖0.4 g，置100 mL量瓶加水溶解并稀释至刻度，混匀作为标准储备溶液，精密量取标准储备溶液用水稀释至含葡萄糖80 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL标准溶液，精密量取各溶液2 mL，分别置于10 mL量瓶中，各加入2%苯酚溶液0.5 mL、硫酸5 mL、水浴中加热15 min，放冷，加水稀释至刻度，用紫外分光光度法于490 nm波长处分别测定吸收度。以吸收度对对照品浓度进行线性回归作图，得标准曲线方程为Y=0.0165X+0.0132，R2=0.999，线性范围为2.5～80 μg/mL。

2.1.2 样品含量测定

精密量取样品溶液(相当于原生药0.05 g/mL)5 mL，置于100 mL量瓶中，加入30%的硫酸锌溶液2 mL，于水浴中加热5 min后，振摇下立即加入亚铁氰化钾试液2 mL，冷却后加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，备用。按照2.1.1的方法测定吸光度，并用标准曲线计算样品溶液的多糖含量。

2.2 马齿苋的提取

2.2.1 单因素试验

通过预试验并参考文献[13-15]，确定采用水煎煮提取方法对马齿苋提取工艺进行研究，分别对料液比(g=mL)、煎煮时间、煎煮次数、水的pH值等进行单因素考察。

2.2.2 正交试验优化马齿苋提取工艺

根据单因素试验结果，选择L9(43)正交表的试验设计对马齿苋的提取工艺进行优化研究，在单因素试验“煎者次数”研究中，发现第2次煎煮得到的提取液中多糖含量仅为第1次的6.0%，同时为降低能耗，直接确定煎者次数为1次。

3.2.2.1 因素与水平

因素与水平设计如表1所示。

表1 因素与水平表

3.2.2.2 正交试验结果与分析

采用L9(43)正交表试验设计，按已定的检测方法，检测各提取液中马齿苋多糖的含量，并对结果进行分析。试验结果与分析见表2、表3。

表2 正交试验结果统计表

表3 方差分析表

正交试验结果表明，影响多糖提取率的因素顺序为：煎煮时间(B)>料液比(A)>水的pH值(C)；其中煎煮时间对提取率影响最大为主要因素，料液比和水的pH值对提取率有一定影响，为次要因数，但方差分析结果显示3个因素对马齿苋多糖提取率的影响均不显著(F<19)。因此最佳提取工艺为A3B2C3，即取马齿苋药材1 kg，加水20 kg(pH 6.5)，煎煮2 h，过滤，浓缩即得。

2.2.2.3 验证试验

为验证正交试验结果的准确性和合理可行，用正交试验结果对马齿苋提取进行了重复试验。试验结果得到3次验证试验结果基本一致，马齿苋多糖平均含量为59.60 mg/g药材，均高于正交试验中的多糖含量数据，表明筛选的提取工艺合理可行，具有很好的重现性和可操作性，如表4所示。

表4 验证试验结果 单位：mg/g

2.2.2.4 浓缩工艺考察

取“验证试验”项下样品，分别于减压(温度60℃～70℃，真空度0.07～0.09 MPa)浓缩至密度为1.3～1.4 g/mL(40℃)的浸膏，多糖含量与浓缩前比较变化不明显，如表5所示。

表5 浓缩工艺考察

3 结论

通过单因素试验和正交试验得出马齿苋的最佳水提取工艺为，取马齿苋药材1 kg，加20 kg水(pH 6.5)，煎煮2 h，滤过，浓缩即得。60℃～70℃，真空度0.07～0.09 MPa条件下浓缩至密度为1.3～1.4 g/mL(40℃)的凝胶状浸膏对马齿苋多糖含量无影响。文献资料中提出用酶分解法、用微波辅助或直接用微波提取法进行提取[11，16-17]，但目前市场上对中药的提取主要还是煎煮、浸提、回流等方法，对设备的要求不高，且成本较低，更容易应用于生产实际中，符合兽药市场的需求。