环状RNA⁃PCAC1在肝癌细胞增殖、侵袭和转移中作用机制研究

何文广 郭海坤 朱晟 刘小梨

肝细胞癌是我国常见的一类恶性肿瘤，具有发病隐匿、治疗手段少及预后差等特点［1］。目前，手术是治疗HCC 最常见的治疗手段，但术后生存形势依然较为严重［2］。因此，进一步探索阐明HC发生及进展的分子机制显得极为迫切。近年来，circRNA 参与参与多种肿瘤发生、侵袭和迁移等恶性生物学行为［3-4］。本课题组前期通过高通量测序检测HCC 患者病理组织异常表达的circRNA，发现其中一种circ_RNA_PCAC1 在HCC 患者表达升高，查阅文献未见其在HCC 中的报道。基于此，因此，本研究检测circ_RNA_PCAC1在肝癌细胞系中的表达，并进一步探讨其对肝癌细胞生物学行为的影响，为阐明其在肝癌中的作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料人肝癌细胞系Li⁃7、HepG2、Hep3B 及人正常肝细胞系HL⁃7702 购自美国ATCC 细胞库，胎牛血清，DMEM 培养基（Gibco，USA），Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司）；逆转录试剂盒和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒购自（日本Takara 公司），引物（生工生物工程科技（上海）有限公司）；CCK⁃8 试剂（碧云天公司），Transwell小室及基质胶（Corning 公司）。circ_RNA_PCAC1沉默慢病毒（siRNA）及相应的阴性对照组慢病毒（NC）（上海吉凯基因科技有限公司）。

1.2 细胞培养肝癌细胞系及正常肝细胞系用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基培养。在37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞融合达到80%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化，并进行传代。

1.3 实时荧光定量PCR 检测circ_RNA_PCAC1 mRNA 的表达水平应用Trizol 法提取细胞总RNA，分光光度计测量总RNA 浓度及纯度，根据逆转录试剂盒说明书将1 μg RNA 按逆转录为合成cDNA，随后进行qRT⁃PCR。内参GAPDH 的引物序列为：F：5′⁃ACA GTC AGC CGC ATC TTC TT⁃3′；R：5′⁃GACAAGCTTCCCGTTCTCAG⁃3′。circ_RNA_PCAC1 引 物 序 列 为：F：5′⁃GAGGGTTCTGCT⁃GTCCTGT；R：5′⁃GATAGACGCGTGCACCAC⁃3′，PCR 反应程序：95 ℃，5 min 预变性；95 ℃30 s 变性，60℃，30 s 退火；72 ℃，30 s 延伸。PCR 反应体系为10 μL ：2×SYBR Green Master（ROX），上下游引物各0.3 μL，cDNA 模板1 μL，RNase Free dH2O补至10 μL，以GAPDH 为内参，使用2-△△Ct法分析目的基因的相对表达量。

1.4 circ_RNA_PCAC1 敲低的肝癌细胞模型胰酶消化细胞接种至6孔板，感染前6 h 更换培养基，慢病毒稀释后与增强感染液混合。参照感染说明书分别将circ_RNA_PCAC1沉默慢病毒及相应阴性对照组慢病毒感染HepG2细胞，分别设为siRNA 组和NC 组，6 h 后替换常规培养基继续培养。感染72 h后，更换含2 μg/mL嘌呤霉素的培养基，继续培养14 d，然后用qRT⁃PCR实验检测感染效率。

1.5 CCK⁃8 检测肝癌细胞增殖能力用胰酶消化处于对数生长期的感染细胞，按5×103个/孔接种于96 孔板中，每组重复5 次。分别于培养0 h、24 h、48 h、72 h 时加入CCK⁃8 试剂10 μL，继续孵育2 h，用酶标仪检测，以450 nm 波长处的光密度（OD）值代表增殖活力。

1.6 平板克隆实验检测增殖能力用胰酶消化处于对数生长期的感染细胞，加入完全培养液5 ml终止消化，1 000 rpm，4℃离心5 min，弃上清；加入3 mL 完全培养液，以200 细胞/孔的密度接种至6孔板，培养至细胞集落形成。4% 多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗3 次，1% 结晶紫染色20 min，拍照记录细胞集落形成情况，计算细胞克隆形成数。

1.7 划痕实验检测迁移能力用胰酶消化处于对数生长期的感染细胞，然后将细胞按5×103个/孔接种于接种于6 孔板，将细胞置于培养箱中常规培养，待细胞的融合达到90%，用10 μL 的无菌枪头划板，弃去原培养基，用PBS 轻轻清洗3 次。分别于划痕后0 h、48 h 时取样，同时利用Image J软件测量迁移距离。

1.8 Transwell 实验检测细胞侵袭能力用胰酶消化处于对数生长期的感染细胞，200 μL 肝癌细胞（含1×105 个细胞）接种至Transwell 小室的上室，用500 μL 含10%胎牛血清置于下室，于37℃、5% CO2培养箱内孵育48 h，4%多聚甲醛固定20 min，苏木素染色30 min，随机选取不同的5 个视野在光学显微镜下拍照并计数，最后取均值作为细胞侵袭数。

1.9 统计分析采用SPSS 19.0 统计软件包进行统计学分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较单因素方差分析（One⁃Way ANOVA），以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 circ_RNA_PCAC1在肝癌细胞和正常肝细胞 中 的 表 达qRT ⁃ PCR 检 测 结 果 显 示：circ_RNA_PCAC1 在人肝癌细胞系Li⁃7、HepG2、Hep3B 中的表达量明显高于HL⁃7702 细胞系（P<0.05），详见图1。

图1 circ_RNA_PCAC1 在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达

2.2 circ_RNA_PCAC1 在肝癌细胞系中的沉默效 果 用qRT ⁃ PCR 法 检 测 siRNA 组 的circ_RNA_PCAC1 表达水平明显低于NC 组（P<0.05），表明成功建立沉默circ_RNA_PCAC1 的HepG2 细胞株。详见图2。

图2 circ_RNA_PCAC1 在肝癌细胞系中的沉默效果

2.3 干扰circ_RNA_PCAC1 表达抑制肝癌细胞HepG2 的增殖通过CCK⁃8 细胞增殖实验检测干扰circ_RNA_PCAC1 后HepG2 细胞的生长变化，结果显示，与NC 组细胞相比，siRNA 组HepG2 细胞明显抑制生长，平板克隆形成实验结果显示siR⁃NA 后细胞形成的克隆数目明显减少（P<0.05）。详见图3。

图3 干扰circ_RNA_PCAC1 表达对肝癌细胞HepG2 增殖的影响

2.4 干扰circ_RNA_PCAC1 表达抑制肝癌细胞HepG2 的迁移细胞划痕实验结果显示：48 h 时，siRNA 组细胞迁移数目均较NC 组少（均P<0.05），见图4。

图4 干扰circ_RNA_PCAC1 表达抑制肝癌细胞HepG2的迁移

2.5 干扰circ_RNA_PCAC1表达抑制肝癌细胞HepG2 的侵袭Transwell 实验结果显示，siRNA组细胞侵袭和迁移数目均较NC 组少（均P<0.05）。详见图5。

图5 干扰circ_RNA_PCAC1 表达抑制肝癌细胞HepG2的侵袭

3 讨 论

高转移和高侵袭性是造成肝癌患者死亡的重要因素［5］。因此，阐明肝癌进展机制，仍是肝癌研究的重要内容。目前多项研究证明环状RNA 异常表达可以促进或抑制肝癌的发生与进展。可望成为潜在的肿瘤诊疗标志物，具有巨大的应用前景。

circ_RNA_PCAC1 是一个新近发现的cir⁃cRNA，国内李玉婷等［6］受研究首次发现circRNA⁃PCAC1 在胰腺导管腺癌中高表达并促进胰腺导管腺癌侵袭转移，然而到目前为止，circ_RNA_PCAC1在肝癌中的表达方式和生物学功能尚不清楚。基于本课题组前期对HCC 组织的测序的结果，本研究进一步发现circ_RNA_PCAC1 在肝癌中表达明显高于旁癌组织。但其是否对肝癌细胞的生物学行为并未研究。本研究首先检测了肝癌细胞和正常肝细胞中 circ_RNA_PCAC1 的表达，发现circ_RNA_PCAC1 在肝癌细胞中的表达均高于正常肝细胞。因此，推测circ_RNA_PCAC1 在肝癌细胞的发生发展中发挥着重要的调控作用。为了进一步明确circ_RNA_PCAC1 在肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移中的作用，本研究建立沉默circ_RNA_PCAC1的HepG2细胞模型，通过细胞体外CCK⁃8细胞增殖实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验以及Tran⁃swell 小室实验全面验证其对肝癌细胞增殖和侵袭等行为的影响，各项结果显示，结果发现沉默circ_RNA_PCAC1 可以显著抑制肝癌细胞在体外的增殖、迁移及侵袭能力，因此，本研究利用体外实验首次证明了circ_RNA_PCAC1在肝细胞癌中的促癌作用。今后将通过生物信息学手段和双荧光素酶等技术手段探索circ_RNA_PCAC1的下游调控网络。

综上所述，circ_RNA_PCAC1 在肝癌细胞中表达上调，沉默circ_RNA_PCAC1 可以明显制肝癌细胞增殖，迁移和侵袭，今后还需深入研究circ_RNA_PCAC 在肝癌发生发展中的确切分子机制。