交叉引物恒温扩增法诊断结核病的价值

高严

【摘要】  目的  评价交叉引物恒温扩增法（crossing-primeramplification，CPA）检测技术诊断结核病的价值。方法  分析泾县医院2019年1月- 2021年6月进行CPA检测的207例疑似结核病住院患者的临床资料，并与罗氏培养检测、涂片改良抗酸染色镜检、结核抗体（tuberculosis antibody，TB-Ab）检测的实验结果相对比，评价各检测方法的诊断效能。结果  以罗氏培养为金标准，CPA检测的灵敏度和特异度分别为63.1%、95.1%，且和罗氏培养结果具有中高等程度的一致性（Kappa=0.626），诊断效能优于涂片改良抗酸染色镜检和结核抗体诊断技术。结论  CPA检测技术与罗氏培养的检测结果相似，但方法简便、快速，可用于疑似结核患者的快速诊断。

【关键词】  结核分枝杆菌;交叉引物恒温扩增;回顾性分析

中图分类号  R521    文献标识码  A    文章编号  1671-0223（2022）17--02

结核病是一种慢性传染病，由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起。2020年我国估计的结核病新患病人数为84.2万，估算的结核病发病率为59/10万，在结核病高负担国家中结核病新患病人数仅低于印度[1]，结核病的防治依然严峻。为了能有效防治结核病，需要在疾病早期能够有一种检测技术可以快速地检测并诊断出MTB。传统的检测方法是从临床标本中（主要是痰液）经过抗酸染色或者培养来鉴定MTB，但它们各自都有优缺点。随着检测技术不断发展，MTB的分子学检测技术得到广泛的应用。交叉引物恒温扩增法（crossing-primeramplification，CPA）检测技术是其中一种快速分子诊断方法，它检测的是结核杆菌复合群特异性的IS16110序列。在恒温条件下，可以一次性进行基因片段的特异性扩增和杂交，然后在密闭的一次性核酸检测装置中使用免疫层析技术，定性检测特异性扩增产物，是中国自主创新的技术[2]。本研究采用对比方式，分析CPA对结核病的诊断价值。

1  对象与方法

1.1  研究对象

以泾县医院2019年1月- 2021年6月进行CPA检测的207例疑似结核病住院患者为研究对象。标本中痰液194例，胸腔积液11例，肺泡灌洗液1例，脓汁1例。本研究以罗氏培养法为金标准，共确诊65例结核病，其中男55例，女10例，年龄24～88岁;非结核患者142例，其中男111例，女31例，年龄18～86岁。

1.2  纳入排除标准

（1）纳入标准：咳嗽，咳痰>2周，痰中带血或咯血以及肺部影像学检测异常等肺结核疑似症状的患者。

（2）排除标准：正在进行规范化抗结核治疗且时间>2周的患者;经综合判断标准未能明确诊断或排除肺结核可能的患者。

1.3  检测方法

（1）CPA检测：采用杭州优思达的检测试剂盒（恒温扩增-试纸条法），标本需要经过液化、洗涤的手工步骤进行前处理，然后加入DNA提取液进行核酸提取，再将提取的核酸加入玻璃化试管中，恒温扩增1h，最后放入检测装置中读取结果。

（2）TB-Ab检测：采取胶体金法，吸取约100μl的血清或血浆加入试剂的样品孔中，15～20min判读结果。结果判断依据试剂说明书。

（3）涂片法：采用改良抗酸染色，标本的处理以及涂片染色步骤和结果判读按照《WS 288-2017肺结核诊断》附录B中的操作步骤进行。

（4）罗氏培养法：采用酸性改良罗氏固体斜面培养，痰液需要加入4%氢氧化钠进行前处理，然后按照参考文献进行标准化操作[3]。

1.4  统计学方法

数据统计分析采用SPSS 25.0统计软件。计数资料组间率的比較采用χ2检验。计算各检测方法的灵敏度、特异度与Kappa值。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  4种检测方法的阳性检出率比较

4种检测方法中，罗氏培养的阳性率最高，涂片法的阳性率最低，组间阳性率比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2  以罗氏培养法为金标准各检测方法的诊断效能

以罗氏培养为金标准，CPA检测诊断的灵敏度最高，特异度略低于涂片法，并且与金标准诊断结果有较高的一致性，且高于其他两种方法，具有临床应用价值，见表2。

3  讨论

TB-Ab是对MTB的免疫学检测方法。TB-Ab检测操作简单，检测速度快，十几分钟可以报告检测结果。在本次研究中TB-Ab检测结核病的阳性率为25.1%，虽然和罗氏培养法的阳性率差异无统计学意义，但是TB-Ab阳性结果只能反映既往感染过MTB，且不能区分卡介苗接种导致的阳性，易造成假阳性。标本溶血或严重脂血也会对结果造成干扰，患者感染MTB早期，以及免疫功能低下或免疫缺陷又会导致结核抗体检测阴性，这是TB-Ab灵敏度低，以及和罗氏培养法结果一致性较差的原因。因此TB-Ab适合对疑似患者的筛查，其结果需结合其他检测结果综合判断。

罗氏培养法、涂片抗酸染色镜检是病原学检测手段。在本研究中罗氏培养的阳性检出率（31.4%）高于涂片抗酸染色（18.4%），有较好的阳性率，也是结核病诊断的金标准。但是由于结核杆菌在培养基上生成缓慢，约2～4周才能形成菌落，培养8周无菌落生长，才能报告阴性结果，这严重制约了结核病的早诊断早治疗。涂片抗酸染色镜检方便快捷，但其阳性率较低，阳性结果依赖于标本中细菌的含量，易造成漏诊，也不利于结核的诊断。

CPA检测是分子学检测手段，在本研究中CPA检测的阳性检出率为23.2%，略低于罗氏培养的阳性率31.4%。以罗氏培养为金标准时CPA检测的灵敏度为63.1%，特异度为95.1%，Kappa=0.626，两者检测结果具有中高程度的一致性，这与坦桑尼亚的一项研究结果相似[4]，但灵敏度和一致性略低于姜晓颖等[5]的一项多中心研究。推测可能的原因在于CPA检测中核酸提取步骤需要手工操作多次，可能会造成核酸物质的损失，另外因为为回顾性研究，无法知道送检的痰液标本的质量，虽然医护人员会进行指导，但患者在自取痰液时执行度有待商榷。相比罗氏培养，CPA检测检测速度快，2h左右报告结果，其结果在密闭的装置中读取，可避免污染，减少假阳性产生[6]。在等待培养结果的过程中可用于快速鉴定MTB。此外有关文献报道，在肺外结核诊断中，以临床诊断为标准，CPA法在菌阳性结核患者中与罗氏培养法有较好一致性，在菌阴性结核患者中优于罗氏培养法[7]，可见CPA检测也能很好地诊断肺外结核。CPA检测技术对结核有较好的检测效能。

綜上所述，CPA检测操作简便，不需要复杂的仪器，利于快速检测。对于疑似的结核患者，可使用TB-Ab对其进行结核病的初筛，再使用CPA检测等分子检测手段快速诊断，并与涂片镜检和培养比较，结合影像学和临床表现综合分析对结核病进行早诊断、早治疗。

4  参考文献

[1] Organization WH.Global tuberculosis report 2021[R].Geneva：World Health Organization，2021.

[2] 王烁程，张林波.结核病实验室检测技术研究进展[J].中国动物检疫，2020，37（3）：78-85.

[3] 赵雁林，王黎霞，成诗明，等.分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册[M].北京：人民卫生出版社，2013：37-49.

[4] Mhimbira FA，Bholla M，Sasamalo M，et al.Detection of mycobacterium tuberculosis by EasyNAT diagnostic kit in sputum samples from Tanzania[J].J Clin Microbiol，2015，53（4）：1342-1344.

[5] 姜晓颖，尹韶华，黄海荣，等.交叉引物扩增法对初诊肺结核患者检测效能的多中心研究[J].中国防痨杂志，2017，39（7）：746-750.

[6] Xu G，Hu L，Zhong H，et al.Cross priming amplification： mechanism and optimization for isothermal DNA amplification[J].Sci Rep，2012，2：246.

[7] 毛秀军，葛晓励，高景利.交叉引物扩增技术在肺外结核早期诊断中的价值[J].中国生物制品学杂志，2016，29（6）：637-640.

[2022-02-12收稿]

作者单位：242500  安徽省宣城市，泾县医院检验科