湛江等鞭金藻多肽AYAPE对UVB诱导的HaCaT细胞抗光老化活性的影响

何苑琳，郑兆婉，周春霞,3，洪鹏志,3

（1.广东海洋大学食品科技学院/广东省水产品加工与安全重点实验室/广东省海洋食品工程技术研究中心/广东省现代农业科技创新中心/广东省海洋生物制品工程实验室，广东 湛江 524088；2.广东海洋大学化学与环境学院，广东 湛江 524088；3.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，大连工业大学，辽宁 大连 116034）

皮肤光老化指的是由外部条件引起的皮肤老化，主要由慢性紫外照射所引起[1，2]。紫外线辐射是一种完全致癌物，辐射中的UVA 和UVB 均可诱导细胞凋亡，从而引起皮肤外观表征和内部结构的变化。UVB 可直接造成细胞DNA 损伤生成嘧啶二聚体，较UVA 来讲对表皮细胞的毒性更强，损伤程度更大，是导致人类皮肤癌的主要致癌物[3，4]。持续UVB 照射可诱导细胞产生氧化应激，通过NF-κB 信号通路导致基质金属蛋白酶（MMPs）的表达上调，从而使皮肤胶原蛋白的合成水平下降，最终表现为皮肤光老化[5]。

应对皮肤光老化的问题日渐受到重视，对抗光老化产品的原料选择也成为热题。湛江等鞭金藻（Isochrysis zhanjiangensis）广泛分布于中国南部湛江湾地区，富含多不饱和脂肪酸[6]。在已有研究中，湛江等鞭金藻可生产生物柴油[7]、低碳烯烃[8]、岩藻黄素[9]等，但对其生理活性的研究较少。本实验室前期从湛江等鞭金藻中提取获得五肽（AYAPE）[10]，研究发现其具有较强的自由基清除能力和抗氧化性能[10]，从中提取的部分多肽还具有抑制酒精性肝病[10]和抗高血压的生理活性[11]。基于此，本研究将通过研究从湛江等鞭金藻中提取的多肽（AYAPE）对经UVB 照射的HaCaT 细胞中基质金属蛋白酶、人Ⅰ型前胶原和凋亡相关蛋白等的影响，以验证AYAPE具备抗光老化活性。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

人永生化角质形成细胞HaCaT，上海澳音生物科技有限公司；MMP-1 ELISA 试剂盒、人Ⅰ型前胶原（PCI）ELISA试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；小鼠多克隆抗体p65（sc-8008）、p-p65（sc-136548）、β-Actin（sc-47778），美国Santa Cruz Biotechnology；Caspase-3（#14220）、Cleaved Caspase-3（#9661）、Caspase-9（#9508）、Cleaved Caspase-9（#20750）、羊抗鼠IgG-HRP（#7076）、羊抗兔IgG-HRP（#7074），美国Cell signaling Technology。

UVB 照射灯（荷兰皇家飞利浦电子公司）；酶标仪（伯腾仪器公司）；倒置显微镜（广州吉迪有限公司）；凝胶成像系统（Bio-Rad 公司）；小型垂直电泳系统（Bio-Rad 公司）；化学发光成像分析系统（上海天能科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 HaCaT 细胞培养及光老化模型的建立 采用完全培养基［含有体积分数10%的胎牛血清（FBS）］，终浓度为1 μmol/L 的青霉素和链霉素的DMEM 培养基），将HaCaT 细胞培养在37 ℃下含有体积分数5% CO2的培养箱中。将处于生长指数期的细胞接种在不同规格的培养皿中贴壁培养，用磷酸盐缓冲溶液（PBS，浓度为0.01 mol/L，pH=7.4）清洗细胞后根据实验需要将细胞分为5 组，空白组不经UVB照射且不添加样品，对照组和3 个样品实验组（10+UVB 组、20+UVB 组、50+UVB 组）中分别加入终浓度为0、10、20、50 μmol/L 的AYAPE 处理2 h，用PBS 清洗细胞3 次后采用40 mJ/cm2的UVB 照射处理细胞，培养24 h后用于实验。

1.2.2 细胞活性测定 不同浓度的AYAPE对HaCaT细胞活力的影响：将细胞接种在96孔板中（200 μL/孔），在37 ℃、体积分数5%CO2的条件下培养24 h，将细胞分为空白组、10 组、20 组、50 组、100 组、150 组，并对其进行相应浓度的AYAPE（0、10、20、50、100、150 μmol/L）处理2 h，并培养24 h 后根据CCK-8 试剂盒说明书，向每孔加入10 μL 的CCK 溶液，置于培养箱内孵育30 min后，用酶标仪测定在450 nm处的光密度。

不同浓度AYAPE（0、10、20、50、100 μmol/L）对UVB照射后HaCaT细胞活力的影响：将细胞接种在96孔板中（200 μL/孔），经37 ℃、体积分数5%CO2的条件培养24 h，将细胞分为空白组、对照组、10+UVB组、20+UVB 组、50+UVB 组、100+UVB 组，对不同样品组进行相应浓度的AYAPE 处理，2 h 后用40 mJ/cm2的UVB 照射细胞，培养24 h，根据CCK-8试剂盒说明书操作，测定细胞在450 nm处的光密度。

1.2.3 酶联免疫吸附测定分泌蛋白含量 将约1×106个细胞接种60 mm 培养皿中，细胞待培养后，经AYAPE（0、10、20、50 μmol/L）处 理 和40 mJ/cm2UVB照射，培养24 h后，取其上清，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液。用BCA 蛋白定量试剂盒对上清液中的蛋白进行定量，确定终浓度为10 μg/mL。根据酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒说明书测定分泌蛋白MMP-1和Ⅰ型前胶原（PCI）的表达水平。

1.2.4 免疫组化染色测定核内p53蛋白水平 在35 mm

培养皿中接种细胞，置于含有体积分数5% CO2的37 ℃培养箱中培养24 h，经AYAPE 和UVB 照射处理，并应激24 h 后，用预冷后的PBS 对细胞进行清洗，采用体积分数4%的多聚甲醛在4 ℃下将细胞固定30 min，用体积分数0.3%的聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）在4 ℃下对细胞通透30 min，再用体积分数5%牛血清白蛋白（BSA）在常温下封闭1 h，加入含体积分数1%的BSA 的p53 抗体在4 ℃下孵育12～16 h，洗去一抗加入荧光二抗，避光孵育2 h，加入细胞骨架红色荧光探针（Actin Red）孵育1 h，最后加入含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗淬灭荧光封片液，并在荧光显微镜下拍照记录。

1.2.5 蛋白质印迹法检测胞内蛋白表达 用不同浓度的AYAPE（0、10、20、50 μmol/L）处理和40 mJ/cm2UVB 照射HaCaT 细胞，24 h 后舍弃上清，PBS 清洗3 次，用含有体积分数1% 苯甲基磺酰氟（PMSF，蛋白酶抑制剂）的RIPA裂解液裂解细胞。裂解后的细胞蛋白经4 ℃、12 000 r/min 条件离心10 min，收集上清。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，并确定蛋白终质量浓度为20～40 μg/mL。使用体积分数10%的聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE胶）分离蛋白，将胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜（NC）膜上，用含体积分数7%脱脂奶粉的TBST缓冲液（浓度为0.01 mol/L，pH=7.4）封闭2 h后，将目的蛋白对应的一抗与蛋白特异性结合，条带在4 ℃中孵育12～16 h，用TBST缓冲液将一抗清洗后加入二抗，室温中孵育2 h 后用TBST 缓冲液洗涤条带，最后置于天能发光站中拍摄条带。

1.3 统计分析

采用Image J、Graphpad Prism 5.0、Excel、Power-Point和Photoshop 软件进行数据处理、分析及制图。所有实验结果以平均值±标准差表示，显著性差异使用单因素方差分析（one-way ANOVA 和t-test分析）。

2 实验结果

2.1 AYAPE对HaCaT细胞活力的影响

CCK8实验结果表明，在同一实验条件下，用不同浓度的AYAPE处理HaCaT细胞，不同浓度的AYAPE对HaCaT 细胞均无明显毒害作用，且不促进细胞增殖(P>0.05)（图1），因此以100 μmol/L 为高浓度来进行下一步测定不同浓度AYAPE 对UVB 照射后HaCaT细胞活力的影响。

图1 不同浓度AYAPE对HaCaT细胞活力的影响Fig.1 Effects of different concentrations of AYAPE on HaCaT cells viability

2.2 AYAPE对UVB照射的HaCaT细胞活力的影响

HaCaT 细胞经UVB 照射后，细胞活力明显下降，在低浓度的AYAPE 处理下，细胞活力明显增加（P<0.001），而用高浓度的AYAPE对HaCaT细胞活力的保护效果则并不明显（P>0.05）（图2）。因此分别选取10、20、50 μmol/L 的AYAPE 作为后续实验浓度。

图2 不同浓度AYAPE对由UVB照射引起的细胞活力损伤保护效果Fig.2 Effects of different concentrations of AYAPE on UVBinduced cell viability

2.3 AYAPE 对UVB 照射的HaCaT 细胞中MMP-1释放量的影响

酶联免疫吸附测定实验结果表明，HaCaT 细胞在40 mJ/cm2的UVB 下，MMP-1 蛋白的分泌增加，经过AYAPE处理的HaCaT细胞所分泌的MMP-1蛋白含量明显下降，并且在低浓度就呈现出显著（P<0.001）的调节作用（图3）。

图3 AYAPE对细胞MMP-1蛋白的分泌水平影响Fig.3 Effect of AYAPE on MMP-1 protein secretion

2.4 AYAPE 对UVB 照射的HaCaT 细胞中Ⅰ型前胶原（PCⅠ）的影响

酶联免疫吸附测定结果表明，经过40 mJ/cm2的UVB 辐射的HaCaT 细胞中，PCI的含量明显减少（P<0.05），AYAPE 的处理可增加细胞中PCI的含量，且含量接近空白组的水平（图4）。

图4 AYAPE对细胞Ⅰ型前胶原（PCⅠ）含量的影响Fig.4 Effect of AYAPE on UVB-induced PCIproduction

2.5 AYAPE 对UVB 照射的HaCaT 细胞中核内p53蛋白的影响

通过染色细胞核与p53 蛋白，在荧光显微镜下观察可以看出，HaCaT 细胞经过UVB 辐射以后，核内的p53 蛋白明显增多，采用多肽AYAPE 处理的组别中，p53 蛋白含量明显减少，并且20+UVB 组与50+UVB组的效果差别不大（图5）。

图5 AYAPE对核内p53蛋白水平的影响Fig.5 Effect of AYAPE on intranuclear p53 protein expression

2.6 多肽AYAPE对NF-κB信号通路的作用

如图6 所示，在经UVB 照射的HaCaT 细胞中，AYAPE 显著降低了NF-κB 信号通路中p65 蛋白的磷酸化水平。与不经AYAPE处理的对照组相比，在AYAPE 处理浓度为10 μmol/L 和20 μmol/L 时表现为差异显著（P<0.01），并在50 μmol/L 的高浓度下表现为差异极显著（P<0.001）。

图6 AYAPE对p-p65蛋白表达作用Fig.6 Effect of AYAPE on expression of p-p65 protein

2.7 AYAPE对UVB照射引起的HaCaT细胞凋亡的作用

通过蛋白质印迹法，对HaCaT细胞内Caspase蛋白含量进行测定。结果表明，经过UVB照射细胞内的Caspase-3蛋白和Caspase-9蛋白被激活，10 μmol/L的AYAPE对抑制Caspase-3蛋白激活没有明显影响（P<0.05），但被20 μmol/L和50 μmol/L的AYAPE所抑制（图7）。对于Caspase-9蛋白，在10 μmol/L和20 μmol/L的AYAPE 处理下，被激活的Caspase-9 蛋白表达明显的减少，并在50 μmol/L的时候抑制效果最强。

图7 AYAPE对被激活的Caspase-3蛋白和Caspase-9蛋白表达作用Fig.7 Effects of AYAPE on expression of cleaved Caspase-3 and Caspase-9 protein

3 讨论

UVB 照射是引起皮肤光老化这种皮肤损伤最重要的环境因素，皮肤持续暴露在UVB下会产生氧化应激、脂质过氧化甚至是细胞死亡，从而引起皮肤损伤[5]。胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质，是维持皮肤紧致的主要结构蛋白，皱纹和脆弱的萎缩性皮肤等皮肤老化迹象主要是由真皮结缔组织中胶原纤维的断裂所引起[12,13]。胶原蛋白是由前胶原蛋白在酶的作用下所形成的，其中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白可被由紫外线诱导产生的MMP-1 所降解[14]。皮肤在持续UVB 照射下，角质细胞中的核因子κB（NF-κB）信号通路可被UVB激活，该通路中一个重要的亚基p65 发生磷酸化并大量表达，进入到细胞核中[15,16]。通过NF-κB 信号通路，在UVB 诱导下MMP-1 的表达会明显增加[17]。本研究中，由UVB 辐射诱导的p-p65 蛋白高表达以及MMP-1 的高分泌，在低浓度AYAPE作用下蛋白表达及分泌已出现明显下降，而Ⅰ型前胶原的表达则出现相反的趋势。表明多肽AYAPE 可通过调节NF-κB 信号通路进而调节MMP-1的含量，使得Ⅰ型前胶原的表达水平得到恢复（图3、4、6）。

细胞凋亡的调节涉及到凋亡小体和凋亡相关蛋白的表达[18]，p53蛋白是一种参与细胞凋亡的核转录因子，可调节DNA损伤引起的细胞周期停滞和细胞凋亡。经UVB诱导后，p53基因会产生一个53 Ku的磷酸化蛋白（p53蛋白被激活），p53蛋白的激活与否可通过其在细胞核和细胞质中的定位表示[19]。此外，大多数凋亡诱导信号都集中在激活的高度保守的半胱天冬酶（Caspase）家族[4]，其中Caspase-9 参与了p53基因所诱导的凋亡途径，Caspase-9 蛋白可由Apaf-1/cytochrome c 途径所加工并激活，进而激活Caspase-3 蛋白[20,21]。本研究结果表明，HaCaT 细胞经过UVB 辐射后，p53 蛋白的核内表达明显增加，Caspase-3和Caspase-9蛋白也被激活。多肽AYAPE的处理下，减少了p53 的核内表达和Caspase-9 的激活，从而使Caspase-3 的激活得到改善。这说明了AYAPE 对HaCaT 细胞的凋亡起到很好的抑制作用（图5、7）。

本研究表明，HaCaT细胞在UVB的辐射下受到损伤，细胞活力出现了明显的下降。多肽AYAPE对提升UVB 诱导的HaCaT 细胞活力有明显的效果（图2），其中一方面通过抑制NF-κB 信号通路的激活，减少了MMP-1 蛋白的分泌，提高Ⅰ型前胶原的表达，能够直接改善胶原蛋白合成变慢和减缓其降解。另一方面则通过由p53依赖的细胞凋亡途径，明显抑制了凋亡相关蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的激活。这说明了多肽AYAPE 能够通过减少胶原蛋白降解和抑制角质细胞凋亡两个途径来起到抗光老化的作用。

研究证明从鱼类[22]、植物[23]、动物[24]中获得的多肽具有抗光老化活性。本研究所使用的多肽AYAPE也被证实其具备与其他来源的生物活性肽同样的抗光老化活性。湛江等鞭金藻作为一种可广泛获得且目前利用低值化的海洋微藻，可为AYAPE解决皮肤光老化问题提供一个可靠且经济的原料选择方向，AYAPE 是一种有研究价值和应用潜力的抗光老化海洋天然多肽。

4 结论

湛江等鞭金藻多肽AYAPE 通过NF-κB 信号通路、MMP-1的分泌、Cleaved Caspase-3 和Cleaved Caspase-9的蛋白表达，对由UVB照射引起的HaCaT细胞光老化现象有很好的抑制作用，为AYAPE应用于具有抗光老化活性的化妆品和护肤品或修复皮肤光损伤的治疗药物提供了理论依据。