甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂的制备及药效研究

张 维，吕朝阳，李博雅，王 聪，葛蓓孛，张克诚，PARK Kyung Seok，施李鸣

（1中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193；2河北农业大学林学院，河北 保定 071001；3广西民族大学，广西林产化学与工程重点实验室，南宁 530006；4韩京大学，韩国 京畿道 17579）

0 引言

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)是Madhaiyan等[1]在2010年发现的一个新的芽孢杆菌属成员。研究发现甲基营养型芽孢杆菌具有显著的促生效果，如王亚楠等[2]研究表明，甲基营养型芽孢杆菌BMF04菌株发酵液能显著提高黄瓜的出苗率、鲜重、茎粗、株高和须根数；黎肇家等[3]发现甲基营养型芽孢杆菌处理黄柏幼苗后叶绿素含量和POD活性增长，显著促进了黄柏幼苗生长；Liu等[4]发现甲基营养型芽孢杆菌DD-1能够促进钾的吸收、生长素的积累以及铁载体的活性，进而促进水稻幼苗的生长。此外，甲基营养型芽孢杆菌具有一定的抑菌效果。Jemil等[5]发现甲基营养型芽孢杆菌DCS1菌株能够抑制和破坏真菌生物膜的形成。Olfa等[6]发现甲基营养型芽孢杆菌39b菌株对根癌土壤杆菌C58和B6表现出显著的的抗菌活性。程敏等[7]发现甲基营养型芽孢杆菌FJS01对多种烟草土传病原菌有明显的拮抗作用。甲基营养型芽孢杆菌不仅对草莓有显著的促生效果，而且能够减缓灰霉菌的侵染，诱导植株产生系统抗性[8]。然而，经农药信息网查询，国内登记的甲基营养型芽孢杆菌菌剂仅有两种。

可湿性粉剂作为生防制剂的主要剂型，具有高产值、高质量、高浓度和便于运输的特点[9]。可湿性粉剂质量的重要指标包括润湿性、悬浮率以及pH等。研究表明，不同的载体对可湿性粉剂的悬浮率、润湿性以及pH均有不同程度的影响[10]。在制剂中添加适宜的表面活性剂是提高药液对靶润湿沉积的有效方法，而药液在靶标体和作物叶片上的沉积、展着以及渗透的好坏，直接影响农药制剂的使用效果[11-12]。另外，研究表明通过气流粉碎和添加助剂能够显著改善可湿性粉剂的润湿性和悬浮率[13]。以前配方的优化研究多为经验和宏观的筛选，优化比较粗放，缺乏理论指导[14]。三角坐标法、正交设计法虽可优化成分组成，但均存在不足，如前者仅支持三种组分间的优化而后者则试验繁琐[15-16]。混料设计作为一种优化物料配比的优良方法，可以科学的指导配方优化，减少实验次数[17]。其因子设计的响应值会随每个因子的数量而变化，因此可以合理选取少量试验点，实现精准预测和分析混料效果。目前，该方法广泛应用于食品[18]、医药[19]和化工[20]等领域，但在研究微生物可湿性粉剂方面只有少数报道。

本实验室在吉林长白山土壤中分离筛选到1株生防菌株NKG-1，通过16S rDNA序列分析并构建系统发育树鉴定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌。前期研究发现，该菌株不仅可以促进番茄植株的生长，而且能够有效防治番茄灰霉病和白粉病[21-22]。目前，对于该菌株的应用直接采用发酵液的方式进行，并未对其剂型进行开发，而发酵液存在运输不便、不易保存等不足，进而限制了其生产应用。为了推动NKG-1产品的生产应用，本文对其载体与助剂进行筛选，通过混料设计优化配比，制备NKG-1的可湿性粉剂，并测试可湿性粉剂对植物的药效，为该菌株的生产应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)NKG-1(CGMCC No.12055)，分离自中国吉林长白山的土壤中，由本实验室保藏。

1.1.2 植株 试验用番茄品种为抗TY粉果番茄，山东安信种苗股份有限公司。

1.1.3 主要试剂 白炭黑，麦克林生物科技有限公司；高岭土、硅藻土、聚乙烯醇(PVA)，上海国药集团化学试剂有限公司；Agrilan 700（改性聚丙烯酸酯共聚物）、Morwet D-425（烷基萘磺酸缩聚物钠盐）、Morwet D-450（烷基萘磺酸缩聚物的钠盐和阴离子磺酸盐的混合物）、Morwet D-500（烷基萘磺酸盐甲醛缩聚物和嵌段共聚物的混合物）、木质素磺酸盐、Morwet EFW（烷基萘磺酸盐和阴离子润湿剂的混合物）、Berol 790A、PetroAA（烷基萘磺酸盐），南京捷润科技有限公司。

1.1.4 主要仪器 ZWY-2102恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；西厨高速多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；MOBILE MINORTM-2000型喷雾干燥机，基伊埃工程技术（中国）有限公司。

1.2 可湿性粉剂理化性能测定

按照国家标准(GB/T 1601—1993)[23]测定NKG-1可湿性粉剂的pH值、国家标准(GB/T 16150—2000)[24]测定NKG-1可湿性粉剂的细度、国家标准(GB/T 5451—2001)[25]测定NKG-1可湿性粉剂的润湿时间、国家标准(GB/T 14825—1993)[26]测定NKG-1可湿性粉剂的悬浮率，采用平板计数法计量NKG-1可湿性粉剂的有效活菌数[27]。

1.3 载体筛选

将NKG-1菌株发酵液(OD600=0.1±0.02)分别与载体白炭黑、高岭土、硅藻土按照一定比例进行吸附，在进风温度为130℃、喷雾压力为0.20 Mpa的条件下经喷雾干燥机干燥喷粉，分别收集各载体的原粉，通过测定比较各原粉的细度、pH值、悬浮率、润湿时间及有效活菌量，筛选出适合吸附NKG-1发酵液的载体。

1.4 助剂筛选

采用助剂单因素试验，筛选适配NKG-1可湿性粉剂的助剂。使用1.3中筛选出的载体制备NKG-1可湿性粉剂原粉，并按照厂家推荐的使用比例将助剂PVA、Agrilan 700、Morwet D-425、Morwet D-450、Morwet D-500、木质素磺酸盐、Morwet EFW、Berol 790A、Petro AA分别与NKG-1可湿性粉剂的原粉进行混合，混匀后经多功能粉碎机进行粉碎，制得含各助剂的样品，比较各助剂样品的悬浮率、润湿时间和有效活菌量，筛选出适合制备NKG-1可湿性粉剂的助剂。

1.5 配方优化

将1.4中筛选出的助剂分别按照质量分数4%、8%和12%的比例与原粉混合，经多功能粉碎机粉碎后测定样品的悬浮率、润湿时间和有效活菌数，初步确定助剂剂量的添加范围。

根据助剂添加的剂量范围采用极端顶点设计法[28]进行混料设计优化，将载体与助剂的质量分数之和设定为1，分别测定所得制剂样品的悬浮率、润湿时间、有效活菌数等理化指标。采用Minita 19软件对试验数据进行分析，得出最优的载体、悬浮剂与润湿剂配比，经喷雾干燥、粉碎后制得NKG-1可湿性粉剂，并用于NKG-1的防病促生试验。

1.6 防病促生试验

1.6.1 NKG-1可湿性粉剂的促生效果研究 试验于2021年3月在北京市中国农业科学院植物保护研究所农用抗生素组温室开展。实验温度、湿度、种植期等栽培条件均保持一致。试验共设4个处理，试验组分别施用NKG-1可湿性粉剂100、200和300倍液，对照组为清水处理，每处理设置3个重复。分别于番茄移栽后第14天进行第1次灌根处理，之后每隔10天处理1次，共处理3次，第3次处理后7天测定番茄的鲜重、干重、根长等生理和形态指标评价其促生效果。

1.6.2 NKG-1可湿性粉剂的防病效果研究 防病试验按照田间药效准则(GB/T 17980.30—2000)[29]进行。试验共设4个处理，试验组分别施用NKG-1可湿性粉剂100、200、300倍液，每组处理10片叶子，设置3个重复。取健康的叶子正面朝上放于玻璃培养皿的吸水纸上，用不同稀释倍数的NKG-1可湿性粉剂喷施番茄叶片，每片叶子喷施20 mL。随后从培养2天的PDA培养基中取出灰霉病菌丝并放置在主叶脉旁，以不喷施NKG-1可湿性粉剂而接种灰霉菌菌丝的离体番茄叶片作为对照。用5.0 mm厚的透明塑料薄膜单独覆盖培养皿，并放置于25℃的温室中（12 h光照/12 h黑暗）培养[21]。测量每个接种菌丝周围形成的叶片病斑直径，以形成病斑的接种点数除以接种总数计算各处理的发病率(%)。采用Xue[30]方法进行生防效果评价。

2 结果与分析

2.1 NKG-1菌株发酵液在不同载体下的理化性能

将NKG-1菌株发酵液(OD600=0.1±0.02)按照一定比例分别吸附于高岭土、硅藻土以及白炭黑，计量不同载体所得原粉的悬浮率、润湿时间和有效活菌数，以评价载体对NKG-1原粉性能的影响。实验结果表明，当使用白炭黑做载体时，其有效活菌量及悬浮率显著高于高岭土和硅藻土，虽然润湿时间较长但在国家标准要求的范围之内，详细的实验数据如表1所示。由于白炭黑相较于高岭土和硅藻土具有一定的价格优势，故本实验选择白炭黑作为NKG-1制剂的载体。

表1 不同载体对NKG-1原粉理化性能的影响

2.2 不同助剂对NKG-1原粉制剂的影响

将不同的助剂按照厂家推荐的使用比例，分别添加到以白炭黑为载体的NKG-1原粉中，测量混合不同助剂后NKG-1原粉的理化指标，筛查相对适合开发NKG-1制剂的助剂。实验结果表明，不同的助剂对有效活菌数、润湿时间和悬浮率具有不同的影响，与对照NKG-1原粉相比，助剂D-450、D-500以及Petro AA对有效活菌数的影响较小；虽然木质素、PVA和Agrilan 700拥有相对高的悬浮率，但其有效活菌数相对较低、润湿时间更长。详细的实验数据如表2所示。而微生物制剂的药效在很大程度上取决于有效活菌数的数量，因此后续的试验以润湿剂D-500和分散剂Petro AA作为NKG-1原粉的助剂。

表2 不同助剂对NKG-1原粉理化性能的影响

2.3 助剂的添加比例对NKG-1制剂的影响

根据2.2所得结果，以Morwet D-425、Morwet D-500和Petro AA为对象，进一步考察3种助剂在不同添加比例下对NKG-1制剂的影响。实验结果表明，随着添加比例的提高，助剂Morwet D-500的润湿效果以及悬浮率均得以提高；助剂Petro AA其润湿效果随着添加剂量的增加而呈现先升高后降低的趋势，而悬浮率则和助剂添加比例呈现正相关的关系；助剂Morwet D-425的润湿效果及悬浮率随着添加比例的增加，均呈现先升高后降低的变化趋势。详细的实验数据如表3所示。综合比较3种助剂对NKG-1制剂的润湿和悬浮效果，助剂Morwet D-500、Petro AA优于助剂Morwet D-425。因此，后续试验选择载体白炭黑和助剂Morwet D-500、Petro AA进行混料设计，以确定NKG-1制剂配方的最佳组成配比。

表3 不同助剂添加比例对NKG-1原粉制剂的影响

2.4 混料设计优化甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂组分配比

根据2.3的试验结果，对制剂的各组分进行上下限设定，采用软件Minitab 19的极端顶点设计方法，选择白炭黑、Morwet D-500和Petro AA进行混料设计，其试验次数和相应比例如图1，即图中的点。试验的具体方案及相应制剂的pH值、悬浮率和润湿时间响应值结果如表4所示。

表4 混料试验设计及其响应值

图1 NKG-1可湿性粉剂组分的极端顶点设计

2.4.1 助剂组分配比对可湿性粉剂pH的影响 助剂Morwet D-500和Petro AA不同配比对pH影响的等值线分析结果如图2所示。随之助剂添加比例的增加，可湿性粉剂的pH值并没有出现太大的波动，说明助剂对可湿性粉剂pH的影响较小，基本上稳定在7.0～7.3之间。此外，不同助剂配比下的制剂pH大小，均符合相应的国家标准。

图2 pH与Morwet D-500、Petro AA的等值线

2.4.2 助剂组分配比对可湿性粉剂悬浮率的影响 助剂Morwet D-500和Petro AA不同配比对悬浮率影响的等值线分析结果如图3所示。在一定范围内随着助剂Morwet D-500含量的增加，可湿性粉剂的悬浮率也随之升高，而Petro AA含量的增加对于提升悬浮效果也有一定作用，但其效果并没有Morwet D-500明显。当Morwet D-500占比在14%～17%，Petro AA占比在10%～14%时，其制剂产品的悬浮性能优良，悬浮率能够达到70%以上。与单一助剂相比，助剂Morwet D-500与Petro AA在一定范围内混配使用，对提升制剂的悬浮率具有一定的协同作用。

图3 悬浮率与Morwet D-500、Petro AA的等值线

2.4.3 助剂组分配比对可湿性粉剂润湿时间的影响 助剂Morwet D-500和Petro AA不同配比对润湿时间影响的等值线分析结果如图4所示。随之两种助剂含量的增加，可湿性粉剂的润湿时间整体上均呈现出减少的趋势，且所有配比下的制剂润湿时间远低于相应国家标准所规定的值，表现出较好的润湿效果。从图4可以看出，当两种助剂混配使用时，Morwet D-500占比在8%～15%，Petro AA占比在10%～12%时，其润湿效果尤其显著，润湿时间在55 s以内。

图4 润湿时间与Morwet D-500、Petro AA的等值线

2.4.4 可湿性粉剂配方的优化及验证 根据中国农药可湿性粉剂质量要求，设定甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂的润湿时间、悬浮率和pH的期望值范围。通过Minitab软件优化得到了1个最优的助剂组成配方范围，即Morwet D-500和Petro AA的质量分数范围分别为15%～17%和10%～14%时，其润湿时间在53.85～66.08 s，悬浮率为68.83%～70.84%。

在此范围内任选一点作为验证制剂的配方，配方质量组成为：白炭黑:Morwet D-500:Petro AA=72:16:12。基于验证配方制成的可湿性粉剂，实测理化指标与预测值接近，说明该预测范围内的制剂配方具有可行性。

2.5 甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂的效果研究

2.5.1 甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂对番茄的促生作用 从图5可以看出，与对照相比，3个不同处理的NKG-1可湿性粉剂灌根对植株均有明显的促生作用。NKG-1可湿性粉剂灌根后的番茄苗与对照组相比生长势强，茎部粗壮，根系尤为发达，鲜重、干重、株高以及根长与对照相比均增加显著。其中在NKG-1可湿性粉剂100倍液处理组中，促生效果尤其显著，鲜重、干重、株高以及根长与对照相比，分别增加了53.34%、61.01%、88.02%、78.53%（表5）。

表5 不同浓度NKG-1可湿性粉剂灌根对番茄的促生作用

图5 NKG-1可湿性粉剂不同稀释倍数对番茄的促生效果

2.5.2 甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂对番茄灰霉病的预防作用 由图6可以看出，随着NKG-1可湿性粉剂稀释倍数的增加，其防病效果也随着降低。植株叶片在喷施NKG-1可湿性粉剂100倍液后，与对照相比，能够有效抑制灰霉菌的侵染，叶片发病率降低了57.67%，平均防治效果为82.02%（表6），对灰霉菌具有较好的防治作用。

表6 不同NKG-1处理浓度下对番茄灰霉病的防治效果

图6 灰霉病菌对离体番茄叶片3天的致病性试验

3 讨论

本研究以NKG-1为研究对象，通过筛选载体、助剂和混料设计确定了其可湿性粉剂组分的最佳配比，达到了微生物农药相关的国家标准，通过盆栽试验和离体试验证明了其对番茄的促生效果和对病害的防治效果，为该菌株的开发和应用奠定了基础。

赵磊[31]、马新[32]研究表明，不同的载体对可湿性粉剂的性能有不同程度的影响，白炭黑与高岭土、硅藻土相比具有更大的比表面积和孔容，表明白炭黑具有更好的吸附能力，是多种化学和生物农药可湿性粉剂制备的重要填料。同时，这也与本实验的研究结果具有一定的相似性。助剂是影响可湿性粉剂性能的另一重要因素，如吐温-20可以显著降低苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂的润湿时间，聚乙烯醇能够提升可湿性粉剂的悬浮效果等[33-34]。合理的制剂组分配比是提升制剂效果的重要手段。相较于三角坐标法及正交设计等传统方法，本研究利用Minitab软件进行混料设计和响应预测，通过合理选取试验点，在降低试验繁琐程度的同时，获得了NKG-1可湿性粉剂载体与助剂间的最佳配方；通过与预测值比较验证了配方比例的可行性，取得了的良好的试验效果。这与刘盼西等[18]、刘振华等[35]、张致军等[36]的研究具有异曲同工之处。此外，盆栽试验表明，NKG-1可湿性粉剂100倍液处理后，与对照相比鲜重、干重、株高以及根长分别增加了53.34%、61.01%、88.02%、78.53%，其效果高于相同处理倍数下的菌株发酵液；同时，其对番茄灰霉病的平均防治效果达到了82.02%，高于菌株发酵液相同处理倍数下的60%[19]。这一结果表明，本实验独自研制的NKG-1可湿性粉剂能够使甲基营养型芽孢杆菌NKG-1充分发挥防病促生的作用，同时也表明NKG-1可湿性粉剂具有广阔的应用潜力。

综上，本研究为NKG-1可湿性粉剂的开发应用提供了理论指导，并具有一定的现实意义。然而本研究仍存在些许问题需要完善，如未开展田间试验效果评价和制剂有效期的测定，因此本研究后续仍有很多研究需要开展。

4 结论

本实验通过筛选明确了NKG-1可湿性粉剂的最适载体和助剂为白炭黑、Morwet D-500以及PetroAA，通过混料设计确定了NKG-1可湿性粉剂的最优质量配比为白炭黑：Morwet D-500:Petro AA=72:16:12，同时，盆栽番茄经NKG-1可湿性粉剂100倍液处理后，其鲜重、干重、株高以及根长分别较清水对照增加了53.34%、61.01%、88.02%、78.53%，且其对番茄灰霉病的平均防治效果达到了82.02%。综合研究表明，本研究研制的NKG-1可湿性粉剂具有广阔的应用潜力。